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      免疫膠體金(Immune colloidal gold)

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

      原理

      免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下,聚合成為特定大小的金顆粒,并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài),稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷,可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合,由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合,所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。

      膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外,還可以與許多其它生物大分子結(jié)合,如SPA、PHAConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀,如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng),加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性,因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。

      膠體金的制備

      根據(jù)不同的還原劑可以制備大小不同的膠體金顆粒。常用來(lái)制備膠體金顆粒的方法如下。

      1.枸櫞酸三鈉還原法

      110nm膠體金粒的制備:取0.01HAuCl4水溶液100ml,加入1%枸櫞酸三鈉水溶液3ml,加熱煮沸30min,冷卻至4,溶液呈紅色。

      215nm膠體金顆粒的制備:取0.01HAuCl4水溶液100ml,加入1%枸櫞酸三鈉水溶液2ml,加熱煮沸15min30min,直至顏色變紅。冷卻后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml,混勻即可。

      315nm、18nm20nm、30nm50nm膠體金顆粒的制備:取0.01HAuCl4水溶液100ml,加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入1%枸櫞酸三鈉水溶液4ml、2.5ml1ml0.75ml,繼續(xù)煮沸約5min,出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒則分別為15nm、1820nm30nm50nm。

      2.鞣酸—枸櫞酸鈉還原法

      A液:1HAuCl4水溶液1ml加入79ml雙餾水中混勻。

      B液:1%枸櫞酸三鈉4ml,1%鞣酸0.7ml,0.1Mol/L K2CO30.2ml,混合,加入雙餾水至20ml

      A液、B液分別加熱至60,在電磁攪拌下迅速將B液加入A液中,溶液變藍(lán),繼續(xù)加熱攪拌至溶液變成亮紅色。此法制得的金顆粒的直徑為5nm。如需要制備其它直徑的金顆粒,則按表所列的數(shù)字調(diào)整鞣酸及K2CO3的用量。

      鞣酸—枸櫞酸鈉還原法試劑配制表

      金粒直徑

      nm

      A

      B

      1HAuCl4

      雙餾水

      1%枸櫞酸三鈉

      0.1Mol/L K2CO3

      1%鞣酸

      雙餾水

      5

      1

      79

      4

      0.20

      0.70

      15.10

      10

      1

      79

      4

      0.025

      0.10

      15.875

      15

      1

      79

      4

      0.0025

      0.01

      15.9875

      3.制備高質(zhì)量膠體金的注意事項(xiàng)

      1)玻璃器皿必須徹底清洗,最好是經(jīng)過(guò)硅化處理的玻璃器皿,或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿,再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性,不能獲得預(yù)期大小的金顆粒。

      2)試劑配制必須保持嚴(yán)格的純凈,所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制,或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜(0.45µm)過(guò)濾,以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。

      3)配制膠體金溶液的pH以中性(pH7.2)較好。

      4)氯金酸的質(zhì)量要求上乘,雜質(zhì)少。最好是進(jìn)口的。

      5)氯金酸配成1%水溶液在4可保持?jǐn)?shù)月穩(wěn)定,由于氯金酸易潮解,因此在配制時(shí),最好將整個(gè)小包裝一次性溶解。

      膠體金標(biāo)記蛋白的制備

      膠體金對(duì)蛋白的吸附主要取決于pH值,在接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或偏堿的條件下,二者容易形成牢固的結(jié)合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí),則會(huì)聚集而失去結(jié)合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)的分子量等都影響膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合。

      1.待標(biāo)記蛋白溶液的制備 將待標(biāo)記蛋白預(yù)先對(duì)0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4透析過(guò)夜,以除去多余的鹽離子,然后100 000g4離心1h,去除聚合物。

      2.待標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備 0.1Mol/L K2CO30.1Mol/L HCl調(diào)膠體金液的pH值。標(biāo)記IgG時(shí),調(diào)至9.0;標(biāo)記McAb時(shí),調(diào)至8.2;標(biāo)記親和層析抗體時(shí),調(diào)至7.6;標(biāo)記SPA時(shí),調(diào)至5.96.2;標(biāo)記ConA時(shí),調(diào)至8.0;標(biāo)記親和素時(shí),調(diào)至910

      由于膠體金溶液可能損壞pH計(jì)的電板,因此,在調(diào)節(jié)pH時(shí),采用精密pH試紙測(cè)定為宜。

      3.膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比的確定

      1)根據(jù)待標(biāo)記蛋白的要求,將膠體金調(diào)好pH之后,分裝10管,每管1ml。

      2)將標(biāo)記蛋白(以IgG為例)以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5µg/ml50µg/ml,分別取1ml,加入上列金膠溶液中,混勻。對(duì)照管只加1ml稀釋液。

      35min后,在上述各管中加入0.1ml 10NaCl溶液,混勻后靜置2h,觀察結(jié)果。

      4)結(jié)果觀察,對(duì)照管(未加蛋白質(zhì))和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管,均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象;而加入蛋白量達(dá)到或超過(guò)最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量,即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的最低用量,在實(shí)際工作中,可適當(dāng)增加10%~20%。

      4.膠體金與蛋白質(zhì)(IgG)的結(jié)合 將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調(diào)pH9.0,電磁攪拌IgG溶液,加入膠體金溶液,繼續(xù)攪拌10min,加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀。常用穩(wěn)定劑是5%胎牛血清(BSA)和1%聚乙二醇(分子量20KD)。加入的量:5BSA使溶液終濃度為1%;1%聚乙二醇加至總?cè)芤旱?/span>110。

      5.膠體金標(biāo)記蛋白的純化

      1)超速離心法:根據(jù)膠體金顆粒的大小,標(biāo)記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時(shí)間。

      BSA做穩(wěn)定劑的膠體金—羊抗兔IgG結(jié)合物可先低速離心(20nm金膠粒用1 200r/min5nm金膠粒用1 800r/min20min,棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結(jié)合物用6 000g,4離心1h;20nm40nm膠體金結(jié)合物,14 000g,4離心1h。仔細(xì)吸出上清,沉淀物用含1BSAPB液(含0.02NaN3),將沉淀重懸為原體積的110,4保存。如在結(jié)合物內(nèi)加50%甘油可貯存于-18保存一年以上。

      為了得到顆粒均一的免疫金試劑,可將上述初步純化的結(jié)合物再進(jìn)一步用10%~30%蔗糖或甘油進(jìn)行密度梯度離心,分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結(jié)合物。

      2)凝膠過(guò)濾法:此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金蛋白結(jié)合物的純化。將膠體金蛋白結(jié)合物裝入透析袋,在硅膠中脫水濃縮至原體積的15110。再經(jīng)1 500r/min離心20min。取上清加至Sephacryl S-400(丙烯葡聚糖凝膠S-400)層析柱分別純化。層析柱為0.8 cm×20cm,加樣量為床體積的110,以0.02Mol/L PBS液洗脫(內(nèi)含0.1BSA0.05NaN3,pH8.2者用IgG標(biāo)記物),流速為8ml/h。按紅色深淺分管收集洗脫液。一般先濾出的液體為微黃色,有時(shí)略混濁,內(nèi)含大顆粒聚合物等雜質(zhì)。繼之為純化的膠體金蛋白結(jié)合物,隨濃度的增加而紅色逐漸加深,清亮透明,最后洗脫出略帶黃色的為標(biāo)記的蛋白組分。將純化的膠體金蛋白結(jié)合物過(guò)濾除菌、分裝,4保存。最終可得到70%~80%的產(chǎn)量。

      6.膠體金蛋白結(jié)合物的質(zhì)量鑒定

      1)膠體金顆粒平均直徑的測(cè)量:用支持膜的鎳網(wǎng)(銅網(wǎng)也可)蘸取金標(biāo)蛋白試劑,自然干燥后直接在透射電鏡下觀察;蛴么姿徕檹(fù)染后觀察。計(jì)算100個(gè)金顆粒的平均直徑。

      2)膠體金溶液的OD520nm值測(cè)定:膠體金顆粒在波長(zhǎng)510nm550nm之間出現(xiàn)最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液(含1BSA,0.02NaN3)將膠體金蛋白試劑作120稀釋,OD5200.25左右。一般應(yīng)用液的OD520應(yīng)為0.20.4。

      3)金標(biāo)記蛋白的特異性與敏感性測(cè)定:采用微孔濾膜免疫金銀染色法(MFIGSSA)。將可溶性抗原(或抗體)吸附于載體上(濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜),用膠體金標(biāo)記的抗體(或抗原)以直接或間接染色法并經(jīng)銀顯影來(lái)檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體,對(duì)金標(biāo)記蛋白的特異性和敏感性進(jìn)行鑒定。

       

       

       
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