原理
免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下,聚合成為特定大小的金顆粒,并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài),稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷,可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合,由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合,所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。
膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外,還可以與許多其它生物大分子結(jié)合,如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀,如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng),加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性,因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。
膠體金的制備
根據(jù)不同的還原劑可以制備大小不同的膠體金顆粒。常用來(lái)制備膠體金顆粒的方法如下。
1.枸櫞酸三鈉還原法
(1)10nm膠體金粒的制備:取0.01%HAuCl4水溶液100ml,加入1%枸櫞酸三鈉水溶液3ml,加熱煮沸30min,冷卻至
(2)15nm膠體金顆粒的制備:取0.01%HAuCl4水溶液100ml,加入1%枸櫞酸三鈉水溶液2ml,加熱煮沸15min~30min,直至顏色變紅。冷卻后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml,混勻即可。
(3)15nm、18nm~20nm、30nm或50nm膠體金顆粒的制備:取0.01%HAuCl4水溶液100ml,加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入1%枸櫞酸三鈉水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml,繼續(xù)煮沸約5min,出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒則分別為15nm、18~20nm、30nm和50nm。
2.鞣酸—枸櫞酸鈉還原法
A液:1%HAuCl4水溶液1ml加入79ml雙餾水中混勻。
B液:1%枸櫞酸三鈉4ml,1%鞣酸0.7ml,0.1Mol/L K2CO3液0.2ml,混合,加入雙餾水至20ml。
將A液、B液分別加熱至
鞣酸—枸櫞酸鈉還原法試劑配制表
金粒直徑 (nm) |
A液 |
B液 |
||||
1%HAuCl4 |
雙餾水 |
1%枸櫞酸三鈉 |
0.1Mol/L K2CO3 |
1%鞣酸 |
雙餾水 |
|
5 |
1 |
79 |
4 |
0.20 |
0.70 |
15.10 |
10 |
1 |
79 |
4 |
0.025 |
0.10 |
15.875 |
15 |
1 |
79 |
4 |
0.0025 |
0.01 |
15.9875 |
3.制備高質(zhì)量膠體金的注意事項(xiàng)
(1)玻璃器皿必須徹底清洗,最好是經(jīng)過(guò)硅化處理的玻璃器皿,或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿,再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性,不能獲得預(yù)期大小的金顆粒。
(2)試劑配制必須保持嚴(yán)格的純凈,所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制,或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜(0.45µm)過(guò)濾,以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。
(3)配制膠體金溶液的pH以中性(pH7.2)較好。
(4)氯金酸的質(zhì)量要求上乘,雜質(zhì)少。最好是進(jìn)口的。
(5)氯金酸配成1%水溶液在
膠體金標(biāo)記蛋白的制備
膠體金對(duì)蛋白的吸附主要取決于pH值,在接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或偏堿的條件下,二者容易形成牢固的結(jié)合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí),則會(huì)聚集而失去結(jié)合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)的分子量等都影響膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合。
1.待標(biāo)記蛋白溶液的制備 將待標(biāo)記蛋白預(yù)先對(duì)0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中
2.待標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl調(diào)膠體金液的pH值。標(biāo)記IgG時(shí),調(diào)至9.0;標(biāo)記McAb時(shí),調(diào)至8.2;標(biāo)記親和層析抗體時(shí),調(diào)至7.6;標(biāo)記SPA時(shí),調(diào)至5.9~6.2;標(biāo)記ConA時(shí),調(diào)至8.0;標(biāo)記親和素時(shí),調(diào)至9~10。
由于膠體金溶液可能損壞pH計(jì)的電板,因此,在調(diào)節(jié)pH時(shí),采用精密pH試紙測(cè)定為宜。
3.膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比的確定
(1)根據(jù)待標(biāo)記蛋白的要求,將膠體金調(diào)好pH之后,分裝10管,每管1ml。
(2)將標(biāo)記蛋白(以IgG為例)以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5µg/ml~50µg/ml,分別取1ml,加入上列金膠溶液中,混勻。對(duì)照管只加1ml稀釋液。
(3)5min后,在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液,混勻后靜置2h,觀察結(jié)果。
(4)結(jié)果觀察,對(duì)照管(未加蛋白質(zhì))和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管,均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象;而加入蛋白量達(dá)到或超過(guò)最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量,即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的最低用量,在實(shí)際工作中,可適當(dāng)增加10%~20%。
4.膠體金與蛋白質(zhì)(IgG)的結(jié)合 將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調(diào)pH至9.0,電磁攪拌IgG溶液,加入膠體金溶液,繼續(xù)攪拌10min,加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀。常用穩(wěn)定劑是5%胎牛血清(BSA)和1%聚乙二醇(分子量20KD)。加入的量:5%BSA使溶液終濃度為1%;1%聚乙二醇加至總?cè)芤旱?/span>1/10。
5.膠體金標(biāo)記蛋白的純化
(1)超速離心法:根據(jù)膠體金顆粒的大小,標(biāo)記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時(shí)間。
用BSA做穩(wěn)定劑的膠體金—羊抗兔IgG結(jié)合物可先低速離心(20nm金膠粒用1 200r/min,5nm金膠粒用1 800r/min)20min,棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結(jié)合物用6
為了得到顆粒均一的免疫金試劑,可將上述初步純化的結(jié)合物再進(jìn)一步用10%~30%蔗糖或甘油進(jìn)行密度梯度離心,分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結(jié)合物。
(2)凝膠過(guò)濾法:此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金蛋白結(jié)合物的純化。將膠體金蛋白結(jié)合物裝入透析袋,在硅膠中脫水濃縮至原體積的1/5~1/10。再經(jīng)1 500r/min離心20min。取上清加至Sephacryl S-400(丙烯葡聚糖凝膠S-400)層析柱分別純化。層析柱為
6.膠體金蛋白結(jié)合物的質(zhì)量鑒定
(1)膠體金顆粒平均直徑的測(cè)量:用支持膜的鎳網(wǎng)(銅網(wǎng)也可)蘸取金標(biāo)蛋白試劑,自然干燥后直接在透射電鏡下觀察;蛴么姿徕檹(fù)染后觀察。計(jì)算100個(gè)金顆粒的平均直徑。
(2)膠體金溶液的OD520nm值測(cè)定:膠體金顆粒在波長(zhǎng)510nm~550nm之間出現(xiàn)最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液(含1%BSA,0.02%NaN3)將膠體金蛋白試劑作1︰20稀釋,OD520=0.25左右。一般應(yīng)用液的OD520應(yīng)為0.2~0.4。
(3)金標(biāo)記蛋白的特異性與敏感性測(cè)定:采用微孔濾膜免疫金銀染色法(MF-IGSSA)。將可溶性抗原(或抗體)吸附于載體上(濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜),用膠體金標(biāo)記的抗體(或抗原)以直接或間接染色法并經(jīng)銀顯影來(lái)檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體,對(duì)金標(biāo)記蛋白的特異性和敏感性進(jìn)行鑒定。