雜交瘤細(xì)胞的大量繁殖
克隆化的細(xì)胞可以在體外進(jìn)行大量培養(yǎng)，收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過(guò)體外培養(yǎng)法得到的單克隆抗體有限，其不能超過(guò)特定的細(xì)胞濃度，且每天要換培養(yǎng)液。而體內(nèi)雜交瘤細(xì)胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細(xì)胞具有從親代淋巴細(xì)胞得來(lái)的腫瘤細(xì)胞的遺傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠（無(wú)胸腺的裸鼠），雜交瘤細(xì)胞就開(kāi)始無(wú)限地繁殖，直至宿主死亡。產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體，這種抗體的效價(jià)往往高于培養(yǎng)細(xì)胞上清液的100~1 000倍。
利用免疫抑制劑，如降植烷、液體石蠟、抗淋巴細(xì)胞血清等，可以加速和促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。
1．材料
（1）經(jīng)高壓滅菌的降植烷。
�。�2）Balb/c鼠：5~8周齡。
（3）雜交瘤細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。
（4）RPMI—1640培養(yǎng)液
（5）新生牛血清
2．操作方法
(1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后１～９周內(nèi)種植細(xì)胞。
(2) 收取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，用５％FCS—1640液洗滌一次，1 000r/min離心10min。
(3) 取樣，用臺(tái)盼蘭染色，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，重新用５％FCS—1640液配成1.0×107細(xì)胞/ml的懸液。
(4) 給注射了降植烷的小白鼠接種雜交瘤細(xì)胞，每只腹腔注射1ml（含1.0×107個(gè)細(xì)胞/ml）。
(5) 接種后10天左右時(shí)間腫瘤體積最大，此時(shí)可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次。血清可由腋下動(dòng)脈或心臟采血后分離。
單克隆抗體的提純
1．材料
(1) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液
20 mMol/L NaCl
(2) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液
40mMol/L NaCl
(3) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液
80 mMol/L NaCl
(4) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液
(5) 飽和硫酸銨液
(6) DEAE—纖維素柱
2．操作方法
（1）小鼠腹水用冷PBS液稀釋4倍后，于1.00×105轉(zhuǎn)離心30min，去沉淀。
（2）在4℃于上清中緩緩滴加飽和硫酸銨液，邊加邊攪拌，使溶液最終為50％硫酸銨濃度。
（3）此溶液置冰中30min~60min，然后5 000r/min離心10min，去上清。
（4）將沉淀溶于Tris－HCl緩沖液（40mMol/L NaCl）中（溶液可能混濁）。
（5）裝入透析袋于Tris－HCl緩沖液（20 mMol/L NaCl）中透析除鹽。
（6）離心去沉淀。
（7）溶液稀釋（1:100或更高倍稀釋）后，于280nm測(cè)蛋白含量，估計(jì)蛋白質(zhì)含量
1A 280unit=0.8mg蛋白質(zhì)
一般每ml腹水中，含有總蛋白約25mg~36mg。
（8）過(guò)DEAE—纖維素柱：纖維素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris緩沖液平衡。透析樣品以Tris緩沖液等量稀釋。
樣品進(jìn)入柱床速度為1ml~2ml/min，以NaCl線形梯度洗脫。大部分單克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脫，也有極少例外的單克隆抗體于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脫。
測(cè)OD280nm收集蛋白峰，單克隆IgG保存?zhèn)溆谩?/p>
雜交瘤產(chǎn)生各種免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪種為主，則決定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多為產(chǎn)生IgM的B淋巴細(xì)胞。免疫多次的多為IgG。
單克隆抗體的鑒定
1．雜交瘤細(xì)胞染色體的檢查 采用秋水仙素裂解法進(jìn)行。
2．單克隆抗體的類型、亞型的測(cè)定：購(gòu)買兔抗小鼠Ig類型和亞型的標(biāo)準(zhǔn)抗血清，采用瓊脂擴(kuò)散法或ELISA夾心法測(cè)定單抗的Ig類型和亞型。
3．單抗的特異性鑒定 可以采用各種方法，如免疫熒光法、ELISA法、間接血凝和免疫印跡技術(shù)等，同時(shí)還需做免疫阻斷試驗(yàn)等。
4．單抗的效價(jià)測(cè)定 可采用凝集反應(yīng)、ELISA或放射免疫測(cè)定。不同的測(cè)定方法效價(jià)不同。培養(yǎng)上清液的效價(jià)遠(yuǎn)不如腹水的效價(jià)。采用凝集反應(yīng)，腹水效價(jià)可達(dá)5×104。而采用ELISA檢查，腹水效價(jià)可達(dá)1.0×106。單抗的效價(jià)以培養(yǎng)上清和腹水的稀釋度表示。
5．必要時(shí)還可以測(cè)定單抗的親和力和識(shí)別抗原表位的能力測(cè)定。