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      單克隆抗體制備技術(shù)

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27

      一、雜交瘤細(xì)胞的大量繁殖
      克隆化的細(xì)胞可以在體外進(jìn)行大量培養(yǎng),收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過體外培養(yǎng)法得到的單克隆抗體有限,其不能超過特定的細(xì)胞濃度,且每天要換培養(yǎng)液。而體內(nèi)雜交瘤細(xì)胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細(xì)胞具有從親代淋巴細(xì)胞得來的腫瘤細(xì)胞的遺傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠(無胸腺的裸鼠),雜交瘤細(xì)胞就開始無限地繁殖,直至宿主死亡。產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體,這種抗體的效價往往高于培養(yǎng)細(xì)胞上清液的100~1 000倍。
      利用免疫抑制劑,如降植烷、液體石蠟、抗淋巴細(xì)胞血清等,可以加速和促進(jìn)腫瘤的生長。
      1.材料
        (1)經(jīng)高壓滅菌的降植烷。
       �。�2)Balb/c鼠:5~8周齡。
      (3)雜交瘤細(xì)胞:取對數(shù)生長期的細(xì)胞。
      (4)RPMI—1640培養(yǎng)液
      (5)新生牛血清
      2.操作方法
        (1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷,注射后1~9周內(nèi)種植細(xì)胞。
        (2) 收取對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞,用5%FCS—1640液洗滌一次,1 000r/min離心10min。
      (3) 取樣,用臺盼蘭染色,計(jì)活細(xì)胞數(shù),重新用5%FCS—1640液配成1.0×107細(xì)胞/ml的懸液。
      (4) 給注射了降植烷的小白鼠接種雜交瘤細(xì)胞,每只腹腔注射1ml(含1.0×107個細(xì)胞/ml)。
      (5) 接種后10天左右時間腫瘤體積最大,此時可由腹腔抽取腹水,每隔1~3天取1次,可取10次。血清可由腋下動脈或心臟采血后分離。
      二、單克隆抗體的提純
      1.材料
      (1) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液
      20 mMol/L NaCl
      (2) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液
      40mMol/L NaCl
      (3) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液
      80 mMol/L NaCl
      (4) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液
      (5) 飽和硫酸銨液
      (6) DEAE—纖維素柱
      2.操作方法
      (1)小鼠腹水用冷PBS液稀釋4倍后,于1.00×105轉(zhuǎn)離心30min,去沉淀。
      (2)在4℃于上清中緩緩滴加飽和硫酸銨液,邊加邊攪拌,使溶液最終為50%硫酸銨濃度。
      (3)此溶液置冰中30min~60min,然后5 000r/min離心10min,去上清。
      (4)將沉淀溶于Tris-HCl緩沖液(40mMol/L NaCl)中(溶液可能混濁)。
      (5)裝入透析袋于Tris-HCl緩沖液(20 mMol/L NaCl)中透析除鹽。
      (6)離心去沉淀。
      (7)溶液稀釋(1:100或更高倍稀釋)后,于280nm測蛋白含量,估計(jì)蛋白質(zhì)含量
      1A 280unit=0.8mg蛋白質(zhì)
      一般每ml腹水中,含有總蛋白約25mg~36mg。
      (8)過DEAE—纖維素柱:纖維素柱高40cm,以20mMol/L NaCl Tris緩沖液平衡。透析樣品以Tris緩沖液等量稀釋。
      樣品進(jìn)入柱床速度為1ml~2ml/min,以NaCl線形梯度洗脫。大部分單克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脫,也有極少例外的單克隆抗體于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脫。
      測OD280nm收集蛋白峰,單克隆IgG保存?zhèn)溆谩?br />雜交瘤產(chǎn)生各種免疫球蛋白,但主要是IgG和IgM,究竟是哪種為主,則決定于抗原的免疫程序。免疫一次,且3天后就取脾,多為產(chǎn)生IgM的B淋巴細(xì)胞。免疫多次的多為IgG。
      三、單克隆抗體的鑒定
      1.雜交瘤細(xì)胞染色體的檢查 采用秋水仙素裂解法進(jìn)行。
      2.單克隆抗體的類型、亞型的測定:購買兔抗小鼠Ig類型和亞型的標(biāo)準(zhǔn)抗血清,采用瓊脂擴(kuò)散法或ELISA夾心法測定單抗的Ig類型和亞型。
      3.單抗的特異性鑒定 可以采用各種方法,如免疫熒光法、ELISA法、間接血凝和免疫印跡技術(shù)等,同時還需做免疫阻斷試驗(yàn)等。
      4.單抗的效價測定 可采用凝集反應(yīng)、ELISA或放射免疫測定。不同的測定方法效價不同。培養(yǎng)上清液的效價遠(yuǎn)不如腹水的效價。采用凝集反應(yīng),腹水效價可達(dá)5×104。而采用ELISA檢查,腹水效價可達(dá)1.0×106。單抗的效價以培養(yǎng)上清和腹水的稀釋度表示。
      5.必要時還可以測定單抗的親和力和識別抗原表位的能力測定。

       

       

       
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