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      免疫細(xì)胞化學(xué)圖像分析常用的測量參數(shù)

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27

      1、灰度

        灰度(grey level)指圖像各種分顏色的深淺程度。比較高級的圖像分析儀可將灰度分成為256級,也有的只能將灰度分成64級,總之都是2n,24是26256是28。免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本上反應(yīng)產(chǎn)物的染色深淺即可用灰度來表示。能將一張標(biāo)本上不同染色深度區(qū)分為幾十或更多的等級,這是人眼所不及的。因此,某些實驗的結(jié)果,如果用光學(xué)顯微鏡作一般的觀察,似乎實驗組與對照組無明顯差異,而用圖像灰度法經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,則可反映出顯著性差異,說明僅僅用顯微鏡觀察是不夠的,在某些情況下可能會辜負(fù)了制片過程中所花費的大量精力,而得不到應(yīng)有的結(jié)果。

        由于免疫反應(yīng)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)不一定是均勻分布的,在同一個細(xì)胞中就可產(chǎn)生各種灰度,這種情況如何進(jìn)行比較?有兩類方法可供選用:一種是測每個細(xì)胞的平均灰度,近年較新型的圖像分析系統(tǒng)有此性能,而比較早期的或比較簡單的圖像分析系統(tǒng)就沒有這種性能,例如某一細(xì)胞在電視屏幕上占有120個像素,按灰度級進(jìn)行測量后,也許120個像素中有十多種不同的灰度,分析儀可立即顯示其平均灰度。另一種方法是在反應(yīng)產(chǎn)物不均勻的細(xì)胞中可用每一種灰度所占的百分率來表示,例如你要觀察1000個細(xì)胞,在這些細(xì)胞中各種灰度所占的百分率可測出,并作出曲線,或用其他統(tǒng)計學(xué)方法處理,來進(jìn)行比較。

        如果用彩色圖像分析儀,除了上述的灰度測量以外,還可以將不同的灰度編成不同的顏色,使圖像更鮮明美麗,而且便于測量。彩色有兩種情況:在屏幕上出現(xiàn)與標(biāo)本一樣的顏色稱為真色(real color),如果將不同的灰度轉(zhuǎn)換成不同的顏色則稱為假色(pseudo color),應(yīng)用假色的目的是增強對比度,來改善對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的視覺識別,同時可增強輪廓用來強調(diào)結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié) 。例如,免疫細(xì)胞化學(xué)中常用的非標(biāo)記抗體過氧化物酶—抗過氧化物酶法,最終反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色,假設(shè)在腦內(nèi)某核團的許多細(xì)胞中,呈現(xiàn)出不同深度的棕色,深淺差別較大者顯示在屏幕上人眼還能區(qū)別,若差別小的則不易區(qū)別了,操作者可將灰度11~15用紅色顯示,灰度16~20用藍(lán)色顯示、灰度21~25用黃色顯示、灰度26~30用綠色顯示等。一般可呈現(xiàn)數(shù)十種顏色。也可以將灰度11~20用深紅色顯示、灰度21~30用淡紅色顯示、灰度31~40用藍(lán)色顯示等,由操作者隨心所欲加以編輯。這種圖像如拍攝下來,旁邊顯示出一條彩色帶,表明什么顏色代表什么范圍的灰度,如此可將一種顏色的免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本轉(zhuǎn)換成多種彩色的,對比鮮明的照片。

        有些圖像分析儀中帶有光密度計組件,光密度計能將掃描器視頻信號變換成對數(shù)等值,然后數(shù)值化,就能用絕對光密度單位來校正。因此,光密度計把被測物的積分光密度作為主要輸出,所謂積分光密度即各個單獨探測的像素密度分布的總和。因為容易得到被測物的面積,也就很容易求出平均密度。光密度在細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)的定量領(lǐng)域內(nèi)極為有用。灰度是一種相對值,因為你可將標(biāo)本上的灰度隨你編輯分為64級、也可將其分為128級或者256組,而光密度是絕對值。在文獻(xiàn)中光密度常用OD表示(optical density)。有的單位購置了圖像分析儀后才發(fā)現(xiàn)不能作光密度測量,但已無法再去掉換,所以在購買前必須詳細(xì)了解其性能,包括屏幕像素數(shù)、有無光密度計組件等。

      2、長度

        形狀不規(guī)則的線形組織結(jié)構(gòu),一般方法很難計算出其長度,如組織中的毛細(xì)血管,神經(jīng)纖維、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)中的各種膜性結(jié)構(gòu)等,以往常用排列稀疏或密度集等詞描述,圖像分析儀則可測出各種圖像周界線的長度。例如:在活檢組織的子宮頸上皮細(xì)胞的電子顯微鏡照片上,測出在一定范圍的細(xì)胞膜長度為8128像素,橋粒長度為1229像素,計算出橋粒長度占細(xì)胞膜總長度的15%,wiernik等用此方法觀察到癌細(xì)胞的橋粒值遠(yuǎn)小于正常細(xì)胞,提出這可能與癌細(xì)胞易于失去相互間的的細(xì)胞連接,從而形成轉(zhuǎn)移有關(guān)。用免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示的神經(jīng)纖維,在局部組織中可能出現(xiàn)縱橫交錯的復(fù)雜圖像,用圖像分析儀可獲得單位面積內(nèi)神經(jīng)纖維的總長度。又如去甲腎上腺素神經(jīng)纖維呈串珠樣,如果測出一定范圍內(nèi)神經(jīng)纖維總長度及局部膨大數(shù)目,即可計算出串珠平均間隔距離,比較精確。

      3、面積

        無論是在光鏡或電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本的觀察中,都要涉及有關(guān)標(biāo)本中某些結(jié)構(gòu)的面積問題。即使是極不規(guī)整的結(jié)構(gòu),用圖像分析法容易算出其面積。在一定的放大倍數(shù)下,每μm2中含多少像素可以測出,畫出待測結(jié)構(gòu)的輪廓,在所勾畫的范圍內(nèi)含多少像素是立即可顯示出來的,這樣,很快可算出面積的數(shù)值。例如免疫電鏡技術(shù)中的鐵蛋白法、膠體金法等,可用上述方法進(jìn)行單位面積中反應(yīng)產(chǎn)物顆粒的計數(shù),可進(jìn)行各種實驗條件的比較。

        曾有人在肝臟切片上進(jìn)行圖像分析,在一定范圍內(nèi)所有細(xì)胞核的總面積顯示為51554像素,其中肝細(xì)胞核總面積為27431像素,可知肝細(xì)胞核占全部細(xì)胞核總面積的53%。

       

       

       
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