（一）材料與試劑
1．精制瓊脂粉
2．打孔器、加樣器、平皿
3．標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，由指定的生物制品廠購買。
4．馬傳染性貧血病瓊脂擴(kuò)散用抗原，由指定的生物制品廠購買。
5．pH7.4PBS液
（二）操作方法
1．取瓊脂粉1g，加含有1/萬硫柳汞的PBS液100ml，水浴加熱使之完全融化。
2．取平皿（直徑9cm），將融化的瓊脂倒入，每個平皿倒入15ml～18ml，使其厚度約
為2.5mm，冷卻后加蓋，放入4℃～8℃冰箱內(nèi)，至少4h。
3．按7孔梅花圖案打孔，中央孔一個，孔徑4mm，外周孔6個，直徑6mm，孔距8mm
（中間孔至外周孔的中心距離），封底。
4．中央孔加抗原，2、5號孔加標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，其余1、3、4、6孔分別加被檢血清，加滿為止。加畢后，平皿加蓋，平放入鋪有數(shù)層濕紗布的帶蓋搪瓷盤內(nèi)，置15℃～30℃條件下孵育。每日觀察一次，連續(xù)3天。
（三）結(jié)果判定
當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原之間出現(xiàn)一條明顯致密的沉淀線時，再進(jìn)行被檢血清孔的判定。
陽性：被檢血清孔與抗原孔之間形成一條沉淀線，或者標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的沉淀線末端向內(nèi)彎向毗鄰的被檢血清孔。
陰性：被檢血清孔與抗原孔之間無沉淀線，且標(biāo)準(zhǔn)血清陽性孔與抗原孔之間的沉淀線直向毗鄰的被檢血清孔。
可疑：標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原孔之間的沉淀線末端似乎彎向毗鄰被檢血清孔，但不易判斷。此種結(jié)果判為可疑�？梢山Y(jié)果必須進(jìn)行復(fù)試，將抗原做2×，4×，6×，8×等倍數(shù)稀釋，進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散，觀察時間可延長至5d，最后判定結(jié)果。