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      標(biāo)記抗原的放射免疫技術(shù)(RIA)

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27
      (一)原理
      當(dāng)抗原遇到相應(yīng)的抗體便形成抗原抗體復(fù)合物(Ag+Ab ↔Ag -Ab),當(dāng)用放射性同位素標(biāo)記抗原再與相應(yīng)的抗體結(jié)合便形成標(biāo)記抗原和抗體復(fù)合物。即: Ag Ab↔ Ag-Ab。當(dāng)標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原一起加入相應(yīng)的抗體時則兩種抗原產(chǎn)生相互的競爭,而生成有標(biāo)記抗原和抗體復(fù)合物以及非標(biāo)記抗原和抗體復(fù)合物。生成標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物與非標(biāo)記抗原的含量在一定的限度內(nèi)是呈反比的,所以利用這個原理去測定未知抗原或抗體。
      ﹡Ag Ag Ab Ag(F)
      +Ab
      Ag Ag Ab(B) Ag
      如果Ag多則*Ag-Ab(即結(jié)合抗原B)生成量減少,*Ag(即游離抗原F)的剩余量就多。相反,Ag少,則*Ag-Ab生成量就多,*Ag的剩余量就少。通過檢測游離抗原F和結(jié)合抗原B,就可知未知抗原的存在與否以及含量的多少。
      (二)放射免疫抗原的制備
      1、完全抗原 為了保證免疫反應(yīng)的特異性,對放射免疫抗原要求的純度較高,必須在90%以上。通常采用電泳、凝膠過濾、離子交換層析等技術(shù)獲得較高純度的抗原。純化的抗原必須經(jīng)過純度鑒定才能使用。鑒定辦法:通過電泳只出現(xiàn)一條沉淀線,或者以圓盤電泳進(jìn)行純度分析。
      2、半抗原 要獲得較好的免疫原性,必須將半抗原與蛋白質(zhì)大分子的載體結(jié)合起來形成一個完全抗原。結(jié)合的載體,通常包括血清白蛋白、 球蛋白、纖維蛋白、甲狀腺球蛋白、雞卵蛋白等。連接方式則因半抗原的功能基團(tuán)與蛋白質(zhì)載體功能基團(tuán)所決定。常用的連接劑有二亞胺、二異氰酸、過碘酸鹽等。
      (三)抗體的制備與提純
      見第八章免疫球蛋白的制備與提純。
      (四)抗原的標(biāo)記
      1.放射性同位素的選擇 選擇同位素的原則。
      ⑴ 定方法簡單、經(jīng)濟(jì)、便于推廣應(yīng)用。
      ⑵ 易于防護(hù)。
      ⑶ 同位素與標(biāo)記物結(jié)合好,不易從標(biāo)記物上脫落。
      ⑷ 對標(biāo)記物不引起輻射損傷,使蛋白變性。
      ⑸ 具有較高的計(jì)數(shù)效率。
      目前常用的同位素有3H、125 I,其它還有14C、35S和32P等。① 3H 因所有的有機(jī)化合物中均含有氫,用3H來置換氫,不至于影響其原有化合物的化學(xué)性質(zhì)。3H的半衰期長,是一個弱 衰變,能量低,便于防護(hù)。一次標(biāo)記可以使用較長時間,采用閃爍儀測量,測量效力可達(dá)60%。3H標(biāo)記要求條件較高,一般需由專門機(jī)構(gòu)來承擔(dān),不易推廣;② 125I 碘標(biāo)記的化合物比度高,標(biāo)記方法簡便,而且標(biāo)記物可在碘化鈉晶體﹟型計(jì)數(shù)器上直接測定。125I發(fā)射 射線,含有酪氨酸的蛋白質(zhì)和多肽均可用放射性I標(biāo)記。目前,連接標(biāo)記技術(shù)已有相當(dāng)發(fā)展,致使許多非蛋白質(zhì)和多肽的半抗原也可以用碘來標(biāo)記。另外碘的放射能量較大,半衰期也較短。
      雖然125I的放射比活性僅為131I的13%,但125I的半衰期較131I長,同位素豐度大,輻射損傷小,計(jì)數(shù)效率也較高,因此125I比131I更為常用。
      表 各種標(biāo)記同位素的性質(zhì)比較
      同位素
      毒性分類
      衰變類型
      半衰期
      3H
      14C
      131I
      125I
      35S
      32P
      低毒
      低毒
      高毒
      低毒
      中毒
      中毒
      ·
      EC·
      12.26年
      5730年
      8.07天
      60.20天
      67.48天
      14.26天
      2.標(biāo)記方法 目前常用的是碘標(biāo)記法。碘化標(biāo)記的方法很多,如氯化碘法、乳過氧化酶法、過氯酸法和連接標(biāo)記法等。但比較起來,氯胺T法最為簡便,效果好,易于采用。
      氯胺T碘化標(biāo)記法的原理:氯胺T是一種氧化劑,在水溶液中可以緩慢地釋放次氯酸,因而可以在標(biāo)記的過程中形成一種能產(chǎn)生溫和氧化效果的中間體,它可使放射性碘離子氧化而呈活潑形式的碘離子,并取代抗原分子中酪氨酸苯環(huán)羥基鄰位的一個或二個氫原子,使之成為含有碘化酪氨酸的多肽鏈。其記過程為:
      ⑴ 將蛋白質(zhì)抗原以0.5Mol/L pH7.5PB液稀釋為20μg/μl,取5μl~10μl。
      ⑵ 取Na125I 5μl(含2mci~3mci)。
      ⑶ 將1mg氯胺T溶于0.5Mol/L pH7.5PB液 0.1ml中。
      ⑷ 再將Na125I和氯胺T分別緩緩加入蛋白質(zhì)液中,于冰浴中邊加邊攪拌,加完后再攪拌5min。
      ⑸ 加0.1ml(含3mg)偏重硫酸鈉(以PB液配制)。
      ⑹ 再加1%碘化鉀液1滴,看液體是否完全透明。如仍呈棕色,應(yīng)繼續(xù)加少許的偏重硫酸鈉。
      ⑺ 過SephadexG50柱,取第一峰,即為碘標(biāo)記的蛋白質(zhì)抗原。
      3.標(biāo)記的最佳條件
      ⑴ 放射性碘比活性要高。
      ⑵ 反應(yīng)體積要小。
      ⑶ 標(biāo)記反應(yīng)的pH值,以pH7.5為宜,超過8.5,碘則取代酪氨酸以外的其它成分。
      ⑷ 氯胺T的用量必須事先測定。其方法為定出在標(biāo)記的蛋白質(zhì)存在時,10%的三氯醋酸能沉淀最大量放射性碘所需要的最小量的氯胺T。氯胺T的用量必須適當(dāng)。用量少,雖能滿足反應(yīng)的要求,但產(chǎn)率低;用量大易使蛋白質(zhì)變性。
      ⑸ 蛋白質(zhì)的濃度決定碘化的效率。對含量中等的氯胺酸的蛋白質(zhì)而言,在蛋白質(zhì)濃度為1mg/ml,蛋白質(zhì)的回收率為100%,濃度為300μg/ml,則為80%~90%,當(dāng)濃度降至50μg/ml時,則回收率只有60%~70%。
      4.標(biāo)記物的鑒定
      ⑴ 放射性化學(xué)純度鑒定是指某一化學(xué)形式的放射性物質(zhì)的放射強(qiáng)度在該樣品中所占放射性總強(qiáng)度的百分比。鑒定方法為:取標(biāo)記的蛋白質(zhì)或多肽抗原液少許,加入1%~2%載體蛋白及等量的15%三氯醋酸,搖勻靜置數(shù)分鐘后,3 000r/min離心15min分別測上清液(含游離碘)及沉淀(含標(biāo)記抗原)的放射活性。一般要求游離碘含量占總放射性碘的5%以下。標(biāo)記抗原貯藏較久后,仍有部分放射碘從標(biāo)記物上脫落下來,使用時應(yīng)除去后再用,否則影響放射免疫分析的精確度。
      ⑵ 免疫化學(xué)活性鑒定:采用碘標(biāo)記的抗原,通常由于氧化劑的作用可引起部分活性的損傷,而采用3H、14C等標(biāo)記的抗原,則不改變抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)。免疫活性的檢查方法:以小量的標(biāo)記抗原加過量的抗體,在適當(dāng)?shù)臈l件下充分反應(yīng)后,分離B、F,分別測定其放射性,算出百分結(jié)合率。此值應(yīng)在80%以上,最大可超過90%。該值越大,表示標(biāo)記的免疫化學(xué)活性損失越少。
      ⑶ 放射強(qiáng)度:放射性強(qiáng)度以比度表示。即單位重量抗原的放射性強(qiáng)度。比度越高,敏感性越高。因此根據(jù)測定需要的敏感度,要求適當(dāng)比度的標(biāo)記抗原。標(biāo)記抗原比度的計(jì)算是依據(jù)放射性碘的利用率。
      (五)B、F分離
      當(dāng)標(biāo)記的抗原與未標(biāo)記的抗原和抗體結(jié)合后,均形成抗原抗體復(fù)合物。由于其濃度低,不能自動沉淀。而放射免疫測定的終點(diǎn)決定于標(biāo)記抗原與競爭者的結(jié)合比,因此將抗原抗體復(fù)合物與游離的標(biāo)記抗原分離得完全與否是放射免疫測定的關(guān)鍵。
      分離技術(shù)的選擇是根據(jù)抗原的特性、待測生物液體的體積、測定需要的敏感度、精確性以及技術(shù)上可達(dá)到的熟練程度等。
      較常用的B、F分離法見表13-2。
      表13-2 B、F分離法
      分離方法
      (B)
      抗原抗體復(fù)合物
      (F)
      游離抗原
      平衡透析
      清蛋白或葡聚糖衣
      活性炭吸附
      凝膠過濾
      微孔濾膜過濾
      電泳和層析電泳
      雙抗體法
      固相抗體法
      硫酸胺沉淀法
      聚乙二醇(分子量6 000)
      在透析袋內(nèi)
      不被活性炭吸附離心
      后于溶液中
      先被洗脫
      在醋酸纖維膜上
      在 球蛋白電泳帶
      被第二抗體沉淀
      結(jié)合到固相物上
      離心后于沉淀中
      離心后于沉淀中
      袋內(nèi)外濃度相等
      被活性炭吸附于沉淀中
      后被洗脫
      通過濾膜被洗掉
      以其自己的電泳泳動度移動
      離心后在上清液中
      在溶解相中
      在溶液中
      在溶液中
      1.鹽析法 利用33%飽和硫酸銨液可使其抗原抗體復(fù)合物沉淀下來。向溶液內(nèi)加入飽和硫酸銨,使其最終飽和度達(dá)到36%左右,搖勻靜置,然后離心沉淀即為標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物,而游離的標(biāo)記抗原仍留于溶液中。此法的缺點(diǎn)是,游離抗原也同時有隨標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物沉淀的可能。
      2.雙抗體法 雙抗體法是目前常用的方法,抗體在與標(biāo)記抗原結(jié)合后,同時還具有對抗抗體的結(jié)合能力,因此用第一抗體動物的提純的免疫球蛋白去注射另一種動物,獲得第二抗體(即抗抗體)。當(dāng)?shù)谝豢贵w與標(biāo)記抗原形成復(fù)合物時再遇上第二抗體即形成 *Ag-Ab1-Ab2(也有Ag-Ab1-Ab2)更大的復(fù)合物而沉淀下來。達(dá)到與游離的抗原分離的目的。此法比較溫和,分離也較完全(可達(dá)80%~90%)。
      3.清蛋白(或葡聚糖衣)活性炭吸附法 是將活性炭懸浮于一定濃度的葡聚糖水溶液中(或清蛋白),葡聚糖分子在活性炭表面形成一層具有一定孔徑網(wǎng)眼的膜,這層膜只允許較小的分子吸附于上面,進(jìn)而被活性炭所吸附,大分子的物質(zhì)被排在門外,不被活性炭吸附。從而達(dá)到分離的目的。最佳分離條件是pH6.5~9.4℃,15min~30min。
      此法快速、方便而且分離效果好。但是當(dāng)標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合不牢固時,待游離抗原被活性炭吸附后打破了抗原抗體反應(yīng)的平衡,而造成抗原抗體復(fù)合物的離解。在這種情況下,此法不能應(yīng)用。
      (六)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
      標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作直接影響到放射免疫測定的敏感性、精確度和工作范圍。
      1.抗體滴定曲線的制作 將抗體進(jìn)行不同的稀釋,然后加入等量的標(biāo)記抗原和非標(biāo)記已知抗原,分離結(jié)合的和游離的標(biāo)記抗原,測出B/F比率,然后與抗體稀釋度(做橫軸)作圖,繪制曲線。以能結(jié)合50%標(biāo)記抗原的抗體稀釋度作為試驗(yàn)中的抗體用量。
      2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。
      根據(jù)抗體滴定曲線,求出能結(jié)合50%標(biāo)記抗原的抗體用量,以此制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(又稱抗原相加線)。

      以此抗體用量,加入不同稀釋度的已知抗原和標(biāo)記的抗原作用一定時間后,分離B、F,測B的放射性,以標(biāo)記Ag與抗體復(fù)合物的脈沖數(shù)或結(jié)合率為縱坐標(biāo),以未標(biāo)記抗原濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖。如得不到直線可通過logit計(jì)算,將曲線換成直線。在坐標(biāo)上,曲線的斜率最大的部分是放射免疫測定的工作范圍。斜率越大,敏感性越高,測定范圍小。斜率小,工作范圍大,而敏感性就較差。

      在同樣條件下,測未知樣品時,只要測出標(biāo)記抗原與抗體復(fù)合物的放射性,算出結(jié)合率,就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知抗原的含量。

       

       

       

       

       

       
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