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      火箭電泳技術(shù)

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27

      (一)原理
      抗原在含有抗體的凝膠中進(jìn)行電泳,在電場作用下,抗原向一個方向移動,在移動的過程中,逐步與凝膠中的抗體結(jié)合而沉淀呈火箭狀。沉淀峰面積越大,說明抗原量越多,二者呈正相關(guān),因此可用于抗原的定量測定。此法具有敏感性高、快速等優(yōu)點(diǎn)。
      (二)材料與試劑
      1.0.05mol/L pH8.6巴比妥緩沖液配成2%的瓊脂。
      2.抗原與抗體
      3.其它材料同免疫電泳。
      (三)操作方法
      1.將2%瓊脂煮沸溶化后,放入60℃水浴箱中。
      2.將適量的抗體用0.05mol/L pH8.6巴比妥緩沖液稀釋至瓊脂同樣的體積量,放入60℃水浴。
      3.將兩者充分混合,立即倒成平板。
      4.瓊脂板冷卻后在一側(cè)打孔,孔徑3mm,孔距6mm。
      5.于孔內(nèi)分別加入不同濃度的定量抗原。
      6.電泳 孔端接負(fù)板。電流強(qiáng)度3mA/cm(或電壓10V/cm),電泳時(shí)間2h~10h。
      7.停止電泳,將瓊脂板于生理鹽水中浸泡24h,中間換液數(shù)次。
      8.染色、脫色、干燥同免疫電泳。
      9.抗體最適量的測定 將已知抗原與抗體以不同濃度梯度進(jìn)行方陣試驗(yàn),找出所形成的火箭狀沉淀線,輪廓清晰,前端尖窄而閉合的抗體最小量作為抗體的最適用量。
      10.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以抗體的最適用量制成瓊脂板,分別用已知的不同濃度抗原(同一濃度的也必須做一批,以求平均值)進(jìn)行電泳,泳畢后染色,測其沉淀峰的高度(或面積),然后以抗原量為縱軸,沉淀峰高度(或面積)為橫軸,制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
      11.對照組的設(shè)置 在測未知抗原的同時(shí),必須設(shè)置已知標(biāo)準(zhǔn)抗原作為電泳對照。
      (四)結(jié)果判定
      在已知標(biāo)準(zhǔn)抗原所形成的沉淀峰的高度,在許可的誤差范圍內(nèi),測其待測抗原所形成的沉淀峰的高度(或面積),然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出它們相應(yīng)的抗原含量。
      (五)注意事項(xiàng)
      1.抗原抗體的用量應(yīng)當(dāng)預(yù)試,抗原太濃,在一定時(shí)間內(nèi)不能達(dá)到最高峰,抗體太濃,則沉淀峰太低而無法測量。預(yù)試峰的合適高度為2cm~5cm。
      2.用優(yōu)質(zhì)瓊脂糖。
      3.一定條件下,電泳時(shí)間要根據(jù)峰的形成情況而定。如形成尖角峰形,表示已無游離抗原。如呈鈍圓形,前面有云霧狀,表示還未到終點(diǎn)。
      4.把瓊脂板置于電泳槽上搭好橋,再加抗原,或啟動電源后,電壓極低時(shí)加樣,以免造成基部過寬的峰型。

       

       

       
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