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      熒光抗體的制備

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27
      (一)免疫球蛋白的提取
      (二) 熒光素
      1. 熒光色素的基本條件
      (1) 具有化學(xué)活性基團,如異硫氰基(-NCS)等,易與免疫球蛋白結(jié)合形成共價鍵。
      (2) 對免疫球蛋白無毒性,不影響抗體活性。
      (3) 熒光效應(yīng)高,與蛋白結(jié)合需要量少。
      (4) 熒光素性能穩(wěn)定,結(jié)合物性能穩(wěn)定,容易貯藏。
      (5) 結(jié)合物的顏色必須與背景組織有良好的反襯作用,易于觀察判定。
      到目前為止,基本符合上述要求的熒光素只有異硫氰酸熒光素(FITC),麗絲胺羅丹明B200(RB200)。
      2.常用的熒光色素
      (1)異硫氰酸熒光素 :又稱異硫氰酸熒光黃,純品為橙黃色粉末。分有結(jié)晶型與粉末型兩種,結(jié)晶型熒光強度大、穩(wěn)定、優(yōu)于粉末型。分子式C21H11O2N5、分子量389,溶于水,易溶于pH8-9.5碳酸鹽緩沖液中。最大吸收波長為495nm。最大發(fā)射波長520nm。異硫氰酸熒光黃性質(zhì)穩(wěn)定,于低溫下可保存二年以上,但久置標(biāo)記抗體能力弱,熒光亮度差,故應(yīng)采用新產(chǎn)品。
      異硫氰酸熒光素借助異硫氰基與蛋白中氨基酸(主要是賴氨酸)的氨基結(jié)合。一個IgG分子有86個氨基酸殘基,一般最多能標(biāo)記16~20個熒光素分子。
      (2)麗絲胺羅丹明:為褐色粉末,不溶于水、易溶于酒精和丙酮。熒光為桔紅色。性質(zhì)穩(wěn)定,可長期保存。分子式C23H29O7NaS2,分子量為580,最大吸收波長570nm,最大發(fā)射波長為600nm。
      由于麗絲胺羅丹明熒光效能較低,一般不單獨使用,多用于與FITC標(biāo)記抗體的反襯染色或雙標(biāo)記配合使用。此染料不能直接與蛋白質(zhì)結(jié)合,必須先用五氯化磷(PCl5)處理,使染料的-SO3Na基變?yōu)?SO3Cl基后,才能在堿性條件下與賴氨酸的氨基結(jié)合,形成穩(wěn)定的硫氨鍵。
      (三) 標(biāo)記方法
      異硫氰酸熒光素常用的標(biāo)記法有以下兩種:
      1. 攪拌法
      (1)取一定量的純IgG液,用0.5Mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋至20mg/ml。
      (2)按熒光素與蛋白質(zhì)比1︰20~1︰100(一般用1︰100)稱取異硫氰酸熒光素,用pH9.5碳酸鹽緩沖液溶解。
      (3)將球蛋白液置于電磁攪拌器上,啟動開關(guān),輕輕攪拌,以不起沫為準(zhǔn)。逐滴加入熒光素液(約10min~15min加完)。加完后,隨時用試紙測定攪拌液的pH值,若低于9.0,則應(yīng)以碳酸鈉溶液調(diào)整。置4℃攪拌6h~12h即可。
      2. 透析法
      (1)將IgG液以0.5Mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋成1%濃度,裝入透析袋中。
      (2)將熒光素配成0.1mg/ml,其量為1%蛋白液的10倍,裝入燒杯中。
      (3)將透析袋置于燒杯中,放電磁攪拌器上4℃攪拌24即可。
      透析法的優(yōu)點是標(biāo)記均勻,非特異性熒光少,但所標(biāo)記的時間長,熒光素的用量多,約比攪拌法多10倍。
      3.影響標(biāo)記的因素
      (1)熒光素與蛋白質(zhì)的比值:這也取決于熒光素的質(zhì)量與保存期。一般而言,粉末狀熒光素以0.025mg/mg~0.05mg/mg蛋白質(zhì)為宜,而結(jié)晶型則只需0.006mg/mg~0.008mg/mg蛋白質(zhì)即可。
      蛋白含量以20mg~25mg/ml為宜,濃度過低標(biāo)記過慢。濃度過高,標(biāo)記效果不好。不過在實踐中,以稍高一些蛋白濃度為好。
      (2)pH值:以pH9.0~9.5為最好。過低標(biāo)記速度慢,過高蛋白質(zhì)容易變性。
      (3)溫度和時間:溫度4℃~25℃均可。溫度與時間是成正比的,溫度低,反應(yīng)慢,溫度高,反應(yīng)快。4℃需要6h~12h,7℃~9℃需要3h~4h,20℃~25℃只需要1h~2h。實踐中可自選。透析法還是以4℃較長時間反應(yīng)為好。
      (4)熒光素的質(zhì)量及有效期。
      (四)標(biāo)記抗體的純化
      標(biāo)記后溶液是一個混合體,它包括蛋白質(zhì)與熒光素的結(jié)合體,還有游離的熒光素、游離的蛋白質(zhì)以及結(jié)合過多的蛋白質(zhì)。對于某些細(xì)菌性的診斷熒光抗體,則只要去除游離的熒光素即可。對于一般組織染色熒光抗體,則要去除過度標(biāo)記的抗體即可。只是對某些特殊要求的組織染色試劑,則必須經(jīng)過仔細(xì)的處理,包括具有特異性交叉反應(yīng)或非特異性反應(yīng)性的除去。
      1. 去除游離的熒光素
      (1)透析法:將標(biāo)記好的抗體放入透析袋中于0.01Mol/L pH7.6 PBS中或生理鹽水中4℃透析數(shù)天,每天換液數(shù)次,直至透析液中無游離色素為止。通常約需5~7天才能透析完畢。
      (2)凝膠過濾:以G25或G50葡聚糖凝膠裝柱進行過濾。次法速度快,一般1h~2 h即可完成。也可以先透析4h~5h,讓大部分游離熒光素除去,再過G25或G50柱。
      2. 去除過度標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子 可采用DEAE—纖維素過柱法。利用階梯洗脫法進行,具體方法如下:
      (1)以0.01Mol/L pH 7.6 PB液洗脫。
      (2)以0.01 Mol/L pH 7.6 PBS液(0.05Mol/L NaCl)洗脫。
      (3)以0.01 Mol/L pH7.6 PBS(0.1Mol/L NaCl)洗脫。
      (4)以0.01 Mol/L PH 7.6PBS(0.2Mol/L NaCl)洗脫。
      收集每部分有熒光抗體的洗脫液管,于495nm測熒光素的OD值,再于280nm測蛋白的OD值,查標(biāo)準(zhǔn)曲線,算出各管熒光素和蛋白質(zhì)的濃度,并計算出F/P比值(見后介紹),將合格者合并,濃縮后分裝小瓶備用。
      層析柱上滯留的過度標(biāo)記的蛋白質(zhì),可用1 Mol/L 的NaCl洗脫。
      3.去除交叉反應(yīng)等非特異性染色因素 非特異性染色的干擾因素,包括免疫血清的不純、類屬抗原以及熒光色素的質(zhì)量不高、標(biāo)本處理不當(dāng)?shù)取?梢砸耘K粉進行吸收。具體做法如下:于每ml標(biāo)記抗體中加入臟器干粉(臟粉制法見附錄)100mg,充分混合,于室溫中振蕩約1 h,然后以10 000 r/min離心30min,吸取標(biāo)記抗體。必要時可減半臟粉用量再處理一次。
      經(jīng)過臟粉吸收后的熒光抗體必須加0.1%疊氮鈉防腐(注意不能加硫柳汞,因為重金屬對熒光素有影響)。分裝小瓶冷凍保存。
      (五)標(biāo)記抗體的鑒定
      1.F/P比值鑒定 熒光色素與球蛋白的結(jié)合率即為F/P比值。分別制備熒光色素與蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
      異硫氰酸熒光素的標(biāo)準(zhǔn)曲線是以0.5Mol/L pH9.5的碳酸鹽緩沖液分別配成0.25μg/ml、0.5μg/ml.、0.75μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml……10.0 μg/ml的濃度,在495nm波長測其OD值,按重量與OD值在坐標(biāo)上制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
      蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線是將牛血清蛋白分別配成0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.4 mg/ml…1.6mg/ml,在280nm測其OD值,并繪制成曲線。按以下公式計算F/P比值:
      1.6× 104 FITCμg/ml FITCμg/ml
      F/P(克分子比值)= × =0.41 ×
      390 抗體mg/ml 抗體mg/ml
      式中1·6×104為抗體蛋白質(zhì)的分子量,390為異硫氰酸熒光素分子量。
      F/P克分子比值以1~2為合適,1~3.5為合格。比值過低敏感性差,比值過高,易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。用于檢查組織細(xì)胞抗原成分,F(xiàn)/P以1~2為好;用于檢查細(xì)菌涂片時,F(xiàn)/P以2~3為好。
      2. 免疫電泳測定 通過免疫電泳可以測定熒光抗體的免疫純度。要求在球蛋白的部位上只出現(xiàn)一條沉淀線。
      3.染色性能的鑒定 包括測定熒光抗體的敏感性與特異性。
      (1)熒光抗體效價的測定:將熒光抗體倍比稀釋,然后用已知抗原制片,分別用各稀釋度去染色,觀察“ ”熒光強度的最大稀釋倍數(shù)即為該熒光抗體的染色滴度(或單位)。實際應(yīng)用時則取2個或3個單位做應(yīng)用的稀釋度。
      (2)熒光抗體的特異性試驗:為了確保熒光抗體的特異性,必須預(yù)先進行下列試驗。①陽性標(biāo)本染色試驗:即用所制熒光抗體去染色已知的相應(yīng)的抗原,結(jié)果應(yīng)是陽性;②陰性標(biāo)本染色試驗:即用所制熒光抗體去染色已知的非相應(yīng)抗原,結(jié)果應(yīng)是陰性;③類屬性抗原染色試驗:取與已知抗原相近的類屬抗原(如炭疽桿菌與枯草桿菌或類炭疽桿菌等),用熒光抗體染色,應(yīng)為陰性,說明特異性強,如不同程度地出現(xiàn)有熒光,說明具有類屬反應(yīng),特異性不強等;④抗體吸收試驗:以過量的相應(yīng)抗原加入熒光抗體中,感作2h~4h,4℃過夜,離心取上清再對相應(yīng)抗原染色,應(yīng)無熒光或熒光顯著消退;⑤染色阻抑試驗:用未標(biāo)記的抗體對相應(yīng)抗原進行染色,沖洗后,再用熒光抗體對相應(yīng)抗原進行染色,結(jié)果觀察,應(yīng)無熒光。阻抑試驗應(yīng)注意抗體與抗原的相應(yīng)比例,未標(biāo)記抗體的比例過小,結(jié)果抗原結(jié)合有剩余,標(biāo)記抗體仍能被結(jié)合而顯示出阻抑不全。當(dāng)抗體比例過大,則抗體的一個結(jié)合點結(jié)合而表現(xiàn)出不牢固,極易被標(biāo)記抗體所置換出來而又顯示出阻抑不全。
       

       

       
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