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      細(xì)胞培養(yǎng)常見問題

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08

      如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基?

      培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)?傊,首選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開始,各種目的無血清培養(yǎng)最好首選AIM V(12005)培養(yǎng)基(SFM)。

      L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎?它在溶液中不穩(wěn)定嗎?

      L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解,但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成,而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。

      GlutaMAX-I是什么?培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I?這個(gè)二肽有多穩(wěn)定?

      GlutaMAX-I 二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。

      GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

      什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?

      酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑:中性時(shí)為紅色,酸性時(shí)為黃色,堿性時(shí)為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng),培養(yǎng)細(xì)胞,尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí),用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè),一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí),不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

      酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑:中性時(shí)為紅色,酸性時(shí)為黃色,堿性時(shí)為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng),培養(yǎng)細(xì)胞,尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí),用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè),一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí),不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

      如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞?

      用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200~2000個(gè)/毫升,在0.1毫升的細(xì)胞懸液中加入0.1毫升的0.4%的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻,數(shù)分鐘后,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞;罴(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭,因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。

      如何消除組織培養(yǎng)的污染?

      當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí),研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母,把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開,用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái),檢查HEPA過濾器。

      高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性,因而,做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。

      1. 在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞,稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。
      2. 分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi),把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
      3. 每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo),如脫落,出現(xiàn)空泡,匯合度下降和變圓。
      4. 確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2~3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2~3代。
      5. 在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。
      6. 重復(fù)步驟4。
      7. 在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4~6代,確定污染是否以已被消除。


      培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么?

      丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源,盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

      Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么?Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別?

      HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會(huì)變堿,Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織,需要用Eagles液,。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織,用Hanks液就可以了。

      二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么?

      二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前,用EDTA清洗細(xì)胞,以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。

      我試用SF900 II時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)良好,但是我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時(shí)效果好。

      如果目的蛋白是一個(gè)后期蛋白,它將與蛋白酶一起表達(dá),這些蛋白酶將會(huì)作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中,這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白,從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無血清配方中,蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題,加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清(少于1%),讓血清給蛋白酶提供作用底物。

      20°C下配制的緩沖液,在較高或較低的溫度下PH值會(huì)改變嗎?

      對(duì)于普通使用的緩沖液,PH值隨溫度變化而變化。

      下表列出溫度改變10℃時(shí),PH值的變化情況:

      例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時(shí)PH值為 7.4-(2x0.310)=6.78

      緩沖系統(tǒng) pKa/20℃ [ Delta]pKa/10℃

      Mes 6.15 -0.110
      Ada 6.60 -0.110
      Pipes 6.80 -0.085
      Aces 6.90 -0.200
      Bes 7.15 -0.160
      Mops 7.20 -0.013
      Tes 7.50 -0.200
      Hepes 7.55 -0.140
      Tricine 8.15 -0.210
      Tris 8.30 -0.310
      Bicine 8.35 -0.180
      Glycylglycine 8.40 -0.280


      室溫下(25?)配制的Tris-HCl溶液,在37℃使用時(shí)PH值是多少?

      緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃時(shí),不同的PH值。

      4°C 25°C 37°C
      8.1 7.5 7.2
      8.2 7.6 7.3
      8.3 7.7 7.4
      8.4 7.8 7.5
      8.5 7.9 7.6
      8.6 8.0 7.7
      8.7 8.1 7.8
      8.8 8.2 7.9
      8.9 8.3 8.0
      9.0 8.4 8.1
      9.1 8.5 8.2
      9.2 8.6 8.3
      9.3 8.7 8.4
      9.4 8.8 8.5


      昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)的最適PH值和滲透壓是多少?

      生長(zhǎng)培養(yǎng)基的PH值對(duì)細(xì)胞的增殖和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會(huì)產(chǎn)生影響。對(duì)于大部分鱗翅類昆蟲細(xì)胞系,在PH值 6.0~6.4范圍的大部分應(yīng)用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類昆蟲細(xì)胞系時(shí),培養(yǎng)基的最適滲透壓是345-380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細(xì)胞培養(yǎng)方式,減少技術(shù)問題,保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內(nèi)。

      High Five細(xì)胞有任何其它名稱嗎?

      High Five細(xì)胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

      PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之間有什么差別

      PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白質(zhì)的單克隆抗體生產(chǎn)培養(yǎng)基。如果作為雜交瘤生產(chǎn)培養(yǎng)基使用,PFHM-II可能需要補(bǔ)充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM既是雜交瘤生產(chǎn)培養(yǎng)基,也是單克隆抗體生產(chǎn)培養(yǎng)基。它包含低水平的蛋白質(zhì)。

      在High Five無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度是多少?

      High Five無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度:0.025 g/L Tween-80,1.0 g/L Pluronic Poly-all。

      High Five細(xì)胞用多大的密度凍存?

      3.0x10E6 cells/ml。

      在我的果蠅培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)形成白色沉淀,加熱后溶解。它是什么?對(duì)我的細(xì)胞有害嗎?

      可能是谷氨酰胺沉淀,但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養(yǎng)基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍,而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復(fù)合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養(yǎng)條件下可以溶解,對(duì)實(shí)驗(yàn)不會(huì)有不利的影響。

      如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細(xì)胞?能用胰蛋白酶消化嗎?

      強(qiáng)力推薦使用脫落細(xì)胞的方法,因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)破壞性最小,生活力最高。正如手冊(cè)上所顯示,通過使用巴斯德吸液管,讓細(xì)胞上培養(yǎng)基流動(dòng)。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在絕對(duì)必要的情況下,才使用胰酶消化細(xì)胞。

      胰酶消化一個(gè)T25瓶的sf9細(xì)胞: 1. 去除培養(yǎng)基。
      2. 用2ml 1xPBS(足以覆蓋細(xì)胞表面)洗滌細(xì)胞,去除PBS。
      3. 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆蓋細(xì)胞表面)。
      4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測(cè)看到5分鐘后它們正在向上移動(dòng)。
      5. 向細(xì)胞中加入2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液,移入錐形管,用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁,移入同一錐形管中。(培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。)
      6. 離心(1100rpm)沉淀細(xì)胞。去除培養(yǎng)基。
      7. 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。傳代。


      在Sf9, Sf21, 和high Five細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí),肝素的使用量是多少?

      為了防止懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集的形成,使用肝素濃度為10單位/毫升細(xì)胞懸液。

      在重新凍存sf9細(xì)胞前,它可以傳多少代?隨著傳代的次數(shù)的增加,它的感染能力會(huì)降低嗎?

      通常情況當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過30次傳代后,應(yīng)該返回凍存。無論什么時(shí)候計(jì)數(shù)時(shí),都應(yīng)該檢查細(xì)胞活力。如果超過95%的細(xì)胞保持有活力和在大約30小時(shí)左右加倍,細(xì)胞仍然可以使用。如果活力和加倍時(shí)間下降,它們的感染力將不在是有效的。

       

       

       
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