直接培養(yǎng)法
· 原理：直接培養(yǎng)支原體于培養(yǎng)基中，觀察其生長及菌落生成。
· 特點(diǎn)：是目前最直接與靈敏之步驟，亦是用來評估其它偵測新步驟之標(biāo)準(zhǔn)步驟。
· 缺點(diǎn)：培養(yǎng)時(shí)間長，須3－5星期才能判斷。有些支原體不能在培養(yǎng)基培養(yǎng)出來 (例如M. hyorhinis)。需同時(shí)培養(yǎng)支原體株作為正反應(yīng)對照組，可能會(huì)造成污染。
· 材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、無菌有蓋螺旋試管(autoclaved)、無菌培養(yǎng)皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培養(yǎng)箱、厭氧缸（厭氧缸長期培養(yǎng)易有污染，所以厭氧包應(yīng)用無菌水，每次打開厭氧缸后，用70% ethanol擦拭內(nèi)壁。）
· 培養(yǎng)基制備：基本配方為Difco PPLO broth(60%), 馬血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培養(yǎng)時(shí)間長，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培養(yǎng)基中以防止其它細(xì)菌污染。
· 10x stock solution (1 liter) ：稱取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸餾水中。以0.22μm無菌過濾膜過濾滅菌。分裝100 ml至瓶中，保存于 -70℃。
· 液體培養(yǎng)基 (1 liter) ：稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸餾水中，加熱攪拌溶解之。滅菌121℃，15分鐘。待溫度降低至室溫后，于無菌操作臺(tái)內(nèi)加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均勻后，分裝至已滅菌之有蓋螺旋試管中，10ml/管。保存于4℃，期限1個(gè)月。
· 固體培養(yǎng)基 (1 liter )：稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸餾水中，加熱溶解之。滅菌121℃，15分鐘。放在50℃水中浴中，待溫度降低至50℃時(shí)，于無菌操作臺(tái)內(nèi)加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解凍之10x stock solution，混合均勻后，倒入60x50㎜之無菌培養(yǎng)皿中，5ml/培養(yǎng)皿。保存于4℃，期限1個(gè)月。
步驟：
· 取1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液或0.2ml細(xì)胞懸浮液，接種于液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)二周，觀察是否有混濁或是pH值改變之情形。培養(yǎng)一周及二周后，分別取0.1 ml液體培養(yǎng)液涂在agar plate上，將其倒放置于37℃厭氧箱培養(yǎng)，培養(yǎng)至少3星期，持續(xù)觀察是否有支原體之菌落出現(xiàn)。
· 另取1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液或0.2ml細(xì)胞懸浮液，涂抹在agar plate上，37℃厭氧培養(yǎng)3星期，持續(xù)觀察是否支原體菌落出現(xiàn)。
· 另作正負(fù)反應(yīng)對照組，正反應(yīng)對照組為Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 與M. arginini (ATCC 23838)。負(fù)反應(yīng)對照組為待測細(xì)胞之新鮮培養(yǎng)基。
結(jié)果判讀：
· 支原體生長較慢，所以先在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)1~2周增殖后，再培養(yǎng)于agar plate上。需至少培養(yǎng)3星期后，才可斷定是否有支原體污染。所以整個(gè)測試需5個(gè)星期才知正確結(jié)果。
· 典型之支原體菌落類似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原體往agar下層生長所致，為圓形無色透明菌落，大小約10-55μm。但是并非所有的支原體皆為似荷包蛋菌落，有些是圓形菌落或是類似粘菌類形態(tài)（slime）。
· 若要區(qū)分細(xì)胞或是氣泡造成的類似菌落，可將其自agar plate上切下，重新培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一星期后再種入agar plate，若是細(xì)胞則不會(huì)生長。
DNA熒光染色法
· 原理︰利用熒光染劑（bisbenzimide, Hoechst 33258）偵測支原體污染。此染劑會(huì)結(jié)合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich區(qū)域，因?yàn)橹гw之DNA中A-T含量占多數(shù)（55～80%），所以可將其染色而偵測。被支原體污染之細(xì)胞經(jīng)染色后，在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一之熒光小點(diǎn)，即為支原體之DNA，證明有支原體之污染。
· 測試步驟用間接步驟，將待測細(xì)胞懸浮液或細(xì)胞培養(yǎng)液接種于指示細(xì)胞培養(yǎng)液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培養(yǎng)指示細(xì)胞再作熒光染色。正負(fù)反應(yīng)對照組亦可以接種于indicator cell內(nèi)作為對照。
· 待測細(xì)胞亦可作直接測試，但需為吸附型細(xì)胞，培養(yǎng)后直接作熒光染色。有些細(xì)胞易有熒光背景，而干擾結(jié)果判讀，則建議使用接種于指示細(xì)胞之步驟。
· 特點(diǎn)︰簡單、經(jīng)濟(jì)與靈敏，廣泛使用，可作為例行之偵測步驟�？梢詡蓽y不易培養(yǎng)之支原體，例如M. hyorhinis，較直接培養(yǎng)法快，約一星期即可知道結(jié)果。
· 缺點(diǎn)：有時(shí)仍會(huì)有熒光背景，影響判讀。
材料︰
· Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate內(nèi)放置無菌22x22mm蓋玻片﹙浸于酒精內(nèi)，使用前過火滅菌﹚，一般吸附型細(xì)胞均能吸附在蓋玻片上。染色后取出蓋玻片，細(xì)胞面朝下放在玻片上觀察。
· Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070)，細(xì)胞須先測試無污染。αMEM with 10鸖 ( medium for Vero cell)
配制試劑:
· 無菌HBSS︰配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm無菌過濾膜過濾滅菌。勿用高壓蒸汽滅菌。
· Hoechst 33258 stock solution（100X）︰稱取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml無菌HBSS，置于棕色瓶中，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至完全溶解后，以1ml分裝至1.5ml小離心管中，貯存于-20℃。
· Hoechst 33258 working reagent︰取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室溫下攪拌45分鐘，置于棕色瓶中并以鋁箔紙包覆，避免光照，貯存于4℃。
· mounting solution︰22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH調(diào)整pH至5.5（pH很重要），貯存于4℃。
· 固定溶液（fixative）︰冰醋酸與甲醇以1︰3之體積比例混合，使用前才配制。
步驟：
· 培養(yǎng)Vero細(xì)胞： Vero細(xì)胞可作長期培養(yǎng)或制作多個(gè)冷凍保存管，測試前解凍培養(yǎng)。測試前一周培養(yǎng)Vero細(xì)胞。
· 在接種測試樣品前一日，以trypsin-EDTA溶液處理Vero細(xì)胞，制成細(xì)胞懸浮液，以1~2x10^4 cells／ml培養(yǎng)于chamber slide中，每個(gè)well加入1ml細(xì)胞懸浮液，于37℃, 5％CO2培養(yǎng)。隔日確定生長良好后，即可接種測試樣品。
· 接種測試樣品：樣品種類：1ml待測之培養(yǎng)基，1ml待測細(xì)胞培養(yǎng)液（可將細(xì)胞稍微刮下），0.05~0.1ml冷凍管之細(xì)胞懸浮液。
· 將測試樣品加入chamber slide內(nèi)，培養(yǎng)5天后，進(jìn)行Hoechst 33258的熒光染色觀察。
· 以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero細(xì)胞作為正反應(yīng)對照組﹙或是已感染支原體之細(xì)胞培養(yǎng)液或冷凍細(xì)胞液），負(fù)反應(yīng)對照組為Vero cell之新鮮培養(yǎng)基( αMEM 10鸖)。
DNA熒光染色檢測︰
· 取出培養(yǎng)5日之Vero細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液。于每個(gè)well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，靜置10 min后，吸除固定液。重復(fù)上述之步驟，風(fēng)干10分鐘。
· 于每個(gè)well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室溫下靜置30 min。
· 吸掉Hoechst 33258染液后，以無菌水洗滌3次，風(fēng)干后加入1滴的mounting solution，并以蓋玻片覆蓋之。
· 以100x-400x熒光顯微鏡觀察。打開水銀光源10 min后，以UV激發(fā)光束(330～380 nm)之濾光鏡，觀察細(xì)胞核外是否有藍(lán)色熒光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)之熒光物產(chǎn)生。
結(jié)果判讀︰
若有支原體污染，在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色熒光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)。其形狀一致，與細(xì)胞殘片染成之不規(guī)則點(diǎn)狀物不同。其熒光可維持?jǐn)?shù)星期。