1.取96孔細胞培養(yǎng)板,每孔中加0.1ml含2×104~10×104靶細胞的培養(yǎng)液(含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液),在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3小時讓細胞帖壁(如果是懸浮細胞可直接進行下一步)
2.用RPMI-1640培養(yǎng)液2~10倍遞次稀釋細胞因子標準品,根據(jù)情況2~5倍遞次稀釋待檢樣品,每孔加0.1ml稀釋的標準品和待檢樣品,每個稀釋度3個重復(fù)孔。對照孔6個:3個陽性對照孔,每孔加0.1ml含大劑量細胞因子的RPMI-1640培養(yǎng)液,3個陰性對照孔,每孔加0.1ml RPMI-1640培養(yǎng)液。在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48小時或預(yù)定的時間。
3.吸去培養(yǎng)液,用PBS洗滌一次(如為懸浮細胞,應(yīng)在吸去上清液前離心培養(yǎng)板)。
4.每孔加0.1ml PBS和10μl MTT染液,在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~6小時。
5.每孔加0.1ml酸化異丙醇,也可用含10% SDS的10mmol/L HCl代替酸化異丙醇,在振蕩器上振蕩混勻,讓還原產(chǎn)物充分溶解。置酶聯(lián)檢測儀上測定光密度(OD)值,檢測波長570nm,參考波長630nm。以O(shè)D值對樣品稀釋度作圖,比較標準曲線和待測樣品曲線即可求得待測樣品中細胞因子的含量。