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      細胞冷凍和復(fù)蘇

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08

      基本原理:

      在長期的細胞培養(yǎng)過程中可能會出現(xiàn)微生物污染或基因型改變等情況,會導(dǎo)致具有優(yōu)良特性細胞系的丟失。為防止這些細胞的丟失,細胞可以經(jīng)快速冷凍并幾乎無限期保存在非常低的溫度下,如液氮(-176℃)。

      試劑和設(shè)備:

      冷凍液: 90%滅活血清 10%DMSO(或甘油),用0.45μm微孔濾膜過濾除菌,4℃保存;
      培養(yǎng)液;
      臺盼藍溶液(0.4%溶解于PBS);
      70%乙醇;
      組織培養(yǎng)瓶;
      15-50 ml 無菌圓錐底離心試管;
      離心機;
      血球計數(shù)板;
      超凈工作臺;
      光學(xué)顯微鏡;
      37℃水;
      冷凍管;
      -80℃冰箱;
      液氮和液氮容器。
      操作步驟:

      (一)冷凍細胞

      1.收集對數(shù)生長期細胞;

      2.以25μl臺盼藍溶液稀釋25μl細胞懸液;用血球計數(shù)板計數(shù)并計算細胞存活率(至少應(yīng)該在90%以上);

      3.細胞懸液在4℃ 條件下200´g離心10分鐘;

      4.將沉淀的細胞重新懸浮在冷凍液中(大約5´106細胞/0.5 ml 冷凍液);

      5.將細胞懸液加入到冷凍管中,每管0.5 ml;

      6.將冷凍管置于-80℃冰箱中;

      7.24小時后,將冷凍管移入液氮罐中;

      8.在記錄本或電腦中記錄下每一個冷凍管的位置以確保在以后應(yīng)用時能夠找到每一個冷凍管。

      (二)細胞復(fù)蘇

      1.將冷凍管迅速由液氮轉(zhuǎn)入到37℃水浴中,冷凍管的頂部保持在水面以上以避免任何污染,不定時攪拌加速解凍;

      2.當(dāng)細胞完全解凍后,用含70%乙醇的紗布擦拭冷凍管消毒;

      3.將解凍后細胞轉(zhuǎn)移到含4℃預(yù)平衡培養(yǎng)液的試管中;

      4.細胞懸液在4℃下200´g離心10分鐘;

      5.棄上清,將細胞重新懸浮在新鮮培養(yǎng)液中;

      6.將細胞轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)瓶,CO2孵箱中培養(yǎng);

      7.是用倒置顯微鏡檢查細胞存活率以及細胞密度,如果細胞密度過高,用培養(yǎng)液稀釋至適宜濃度。

      對照試驗

      在冷凍細胞被移入到液氮罐中一段時間后,取出一管細胞復(fù)蘇并進行培養(yǎng)以檢測存活率。

      實驗要點及說明:

      1.嚴(yán)格遵守液氮操作規(guī)則(即戴上合適的手套和護目鏡),液態(tài)氮對眼睛極為有害;

      2.對一瓶細胞培養(yǎng)液要盡可能多分裝幾個冷凍管;

      3.延長暴露在DMSO中的時間對細胞有害,因此冷凍和解凍操作要盡可能快;

      4.細胞可以暫時穩(wěn)定保存在-80 ℃達數(shù)月;

      5.每批次冷凍和復(fù)蘇的細胞的存活率可能會不相同,為避免這個問題,每次細胞凍存最好分兩批以上進行;

      6.DMSO可以防止在細胞內(nèi)部出現(xiàn)冰結(jié)晶,凍存過程需要逐步降低溫度;

      7.如果復(fù)蘇后細胞難以恢復(fù)到良好狀態(tài),可以使用含10%鼠胚胎成纖維母細胞培養(yǎng)上清的培養(yǎng)液以促進恢復(fù);

      8.也可以用含20%熱滅活胎牛血清和10%DMSO的培養(yǎng)液為冷凍液。

       

       

       
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