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      細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08

      一、原代細(xì)胞培養(yǎng)
      (一)原理
      細(xì)胞培養(yǎng)(Cell culture)是模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件,將細(xì)胞從機(jī)體中取出,在人工條件下使其生存、生長(zhǎng)、繁殖和傳代,進(jìn)行細(xì)胞生命過(guò)程、細(xì)胞癌變、細(xì)胞工程等問(wèn)題的研究。近年來(lái),廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞工程等領(lǐng)域,發(fā)展成一種重要生物技術(shù),并取得顯著成就。由體內(nèi)直接取出組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)叫原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細(xì)胞離體時(shí)間短,性狀與體內(nèi)相似,適用于研究。一般說(shuō)來(lái),幼稚狀態(tài)的組織和細(xì)胞,如:動(dòng)物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進(jìn)行原代培養(yǎng)。
      (二)操作
      1.取材
      用頸椎脫位法使乳兔迅速死亡。然后,把整個(gè)動(dòng)物浸入盛有75%乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒,取出后放在大平皿中攜入超凈臺(tái)。用消過(guò)毒的剪刀剪開(kāi)用碘酒和乙醇再次消毒后的皮膚,剖腹取出肝臟或腎臟。置于無(wú)菌平皿中。
      2.切割
      用滅菌的PBS液將取出的臟器清洗三次,然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎,直到成1mm3左右的小塊,再用PBS清洗,洗到組織塊發(fā)白為止。移入無(wú)菌離心管中,靜置數(shù)分鐘,使組織塊自然沉淀到管底,棄去上清。
      3.消化、接種培養(yǎng)
      吸取0.25%胰蛋白酶一0.02%EDTA混合消化液1ml,加入離心管中,與組織塊混勻后,加上管口塞子,37℃水浴中消化8~10分鐘,每隔幾分鐘搖動(dòng)一下試管,使組織與消化液充分接觸,靜止,吸去上清,向離心管中加入5~10ml含5%小牛血清的MEM培養(yǎng)基,用吸管吹打混勻,移入二個(gè)培養(yǎng)瓶中,置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
      (三)結(jié)果
      細(xì)胞接種后一般幾小時(shí)內(nèi)就能貼壁,并開(kāi)始生長(zhǎng),如接種的細(xì)胞密度適宜,5天到一周即可形成單層。
      二、傳代細(xì)胞培養(yǎng)
      (一)原理
      體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞或細(xì)胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代,以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞,并維持細(xì)胞種的延續(xù)。培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后,由于密度過(guò)大生存空間不足而引起營(yíng)養(yǎng)枯竭,將培養(yǎng)的細(xì)胞分散,從容器中取出,以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng),即為傳代培養(yǎng)。
      細(xì)胞“一代”指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間,與細(xì)胞世代或倍增不同。在一代中,細(xì)胞培增3~6次。細(xì)胞傳代后,一般經(jīng)過(guò)三個(gè)階段:游離期、指數(shù)增生期和停止期。
      常用細(xì)胞分裂指數(shù)表示細(xì)胞增殖的旺盛程度,即細(xì)胞群的分裂相數(shù)/100個(gè)細(xì)胞。一般細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.2%~0.5%,腫瘤細(xì)胞可達(dá)3~5%。細(xì)胞接種2~3天分裂增殖旺盛,是活力最好時(shí)期,稱(chēng)指數(shù)增生期(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期),適宜進(jìn)行各種試驗(yàn)。
      (二)操作
      1.將長(zhǎng)成單層的原代培養(yǎng)細(xì)胞或HeLa細(xì)胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出,在超凈工作臺(tái)中倒掉瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液,加入少許消化液。(以液面蓋住細(xì)胞為宜),靜置5~10分鐘。
      2.在倒置鏡下觀察被消化的細(xì)胞,如果細(xì)胞變園,相互之間不再連接成片,這時(shí)應(yīng)立即
      在超凈臺(tái)中將消化液倒掉,加入3~5ml新鮮培養(yǎng)液,吹打,制成細(xì)胞懸液。
      3.將細(xì)胞懸液吸出2ml左右,加到另一個(gè)培養(yǎng)瓶中并向每個(gè)瓶中分別加3ml左右培養(yǎng)液,蓋好瓶塞,送回二氧化碳培養(yǎng)箱中,繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。
      (三)結(jié)果
      一般情況,傳代后的細(xì)胞在2小時(shí)左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上,2~4天就可在瓶?jī)?nèi)形成單層,需要再次進(jìn)行傳代。
      三、器材及液體的準(zhǔn)備和無(wú)菌操作的注意事項(xiàng)
      (一)器材和液體的準(zhǔn)備
      細(xì)胞培養(yǎng)用的玻璃器材,如:培養(yǎng)瓶、吸管等在清洗干凈以后,裝在鋁盒和鐵筒中,120℃,2小時(shí)干烤滅菌后備用;手術(shù)器材、瓶塞、配制好的PBS液用滅菌鍋15磅,20分鐘蒸氣滅菌;MEM培養(yǎng)液、小牛血清、消化液用G6濾器負(fù)壓抽濾后備用。
      (二)無(wú)菌操作中的注意事項(xiàng)
      在無(wú)菌操作中,一定要保持工作區(qū)的無(wú)菌清潔。為此,在操作前要認(rèn)真地洗手并用75%乙醇消毒。操作前20~30分鐘起動(dòng)超凈臺(tái)吹風(fēng)。操作時(shí),嚴(yán)禁說(shuō)話(huà),嚴(yán)禁用手直接拿無(wú)菌的物品,如瓶塞等,而要用器械,如止血鉗、鑷子等去拿。培養(yǎng)瓶要在超凈臺(tái)內(nèi)才能打開(kāi)瓶塞,打開(kāi)之前用乙醇將瓶口消毒,打開(kāi)后和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下,打開(kāi)瓶口后的操作全部都要在超凈臺(tái)內(nèi)完成。操作完畢后,加上瓶塞,才能拿到超凈臺(tái)外。使用的吸管在從消毒的鐵筒中取出后要手拿末端,將尖端在火上燒一下,戴上膠皮乳頭,然后再去吸取液體?傊,在整個(gè)無(wú)菌操作過(guò)程中都應(yīng)該在酒精燈的周?chē)M(jìn)行。

       

       

       
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