1. 原理:
1.1. 計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coulter counter 粒子計數(shù)器自動計數(shù)。
1.2. 血球計數(shù)盤一般有二個chambers,每個chamber 中細刻9 個1 mm2 大正方形,其中4 個角落之正方形再細刻16 個小格,深度均為0.1 mm。當chamber 上方蓋上蓋玻片后,每個大正方形之體積為1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用時,計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目,乘以稀釋倍數(shù),再乘以104,即為每ml 中之細胞數(shù)目。
1.3. 存活測試之步驟為dye exclusion,利用染料會滲入死細胞中而呈色,而活細胞因細胞膜完整,染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue 染料,如果細胞不易吸收trypan blue,則用紅色之Erythrosin bluish。
2. 材料:
2.1. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2.2. Erythosin bluish stain
取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl
paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca /Mg free saline
2.3. 血球計數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometer and coverslip)
2.4. 計數(shù)器(counter)
2.5. 低倍倒立顯微鏡
2.6. 粒子計數(shù)器(Coulter counter, Coulter Electronics)
3. 步驟:
3.1. 取50ml 細胞懸浮液與50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等體積混合均勻于1.5ml 小離心管中。
3.2. 取少許混合液(約15ml) 自血球計數(shù)盤chamber 上方凹槽加入,蓋上蓋玻片,于100 倍倒立顯微鏡下觀察,活細胞不染色,死細胞則為藍色(或紅色- Erythrosin bluish)。
3.3. 計數(shù)四個大方格之細胞總數(shù),再除4,乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2,因與trypan blue 等體積混合),最后乘以104 ,即為每ml 中細胞懸浮液之細胞數(shù)。若細胞位于線上,只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。
4 大格*細胞總數(shù)x 2 x 104 / 4= 細胞數(shù)/ml
*每一大格的體積= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml
3.4. 若不用血球計數(shù)盤,可用Coulter counter 作自動計數(shù),惟無法辨別死細胞或活細胞。
3.5. 范例:
T75 monolayer culture 制成10ml 細胞懸浮液,取0.1 ml 溶液與0.1ml trypan blue 混合均勻于試管中,取少許混合液加入血球計數(shù)盤,計數(shù)四大方格內(nèi)之細胞數(shù)目。
活細胞數(shù)/方格:55 ,62, 49, 59
死細胞數(shù)/方格:5, 3, 4, 6
細胞總數(shù)= 243
平均細胞數(shù)/方格= 60.75
稀釋倍數(shù)= 2
細胞數(shù)/ml:60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106
細胞數(shù)/flask: 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106
存活率:225/243﹦92.6 %