周德慶微生物學(xué)筆記
第一節(jié)：微生物學(xué)的研究對象與任務(wù)
一、"微生物"的含義（什么是微生物）
非分類學(xué)上名詞，來自法語"Microbe"一詞。
是形體微小、單細胞或個體結(jié)構(gòu)簡單的多細胞、甚或無細胞結(jié)構(gòu)的低等生物的通稱。（插入）
二、生物分界（微生物在生物界的位置）
1、兩界系統(tǒng)（亞里斯多德）
動物界 Animalia：不具細胞壁，可運動，不行光合作用。
植物界 Plantae：具有細胞壁，不運動，可行光合作用。
三界：原生生物界 Protista：（E. H. Haeckel, 1866年提出）
2、五界系統(tǒng)
R. H. Whitakker, Science, 163: 150-160, 1969
原核生物界 Monera：細菌、放線菌等
原生生物界 Protista：藻類、原生動物、粘菌等
真菌界 Fungi：酵母、霉菌
動物界 Animalia：
植物界 Plantae：
五界系統(tǒng)是以細胞結(jié)構(gòu)分化的等級以及和光合、吸收、攝食這三種主要營養(yǎng)方式有關(guān)的組織類型為基礎(chǔ)的。
六界：加上病毒界。
3、三界（域）系統(tǒng)
Woese用寡核苷酸序列編目分析法對60多株細菌的16SrRNA序列進行比較后，驚奇地發(fā)現(xiàn)：產(chǎn)甲烷細菌完全沒有作為細菌特征的那些序列，于是提出了生命的第三種形式--古細菌(archaebacteria)。隨后他又對包括某些真核生物在內(nèi)的大量菌株進行了16Sr
RNA(18SrRNA)序列的分析比較，又發(fā)現(xiàn)極端嗜鹽菌和極端嗜酸嗜熱菌也和產(chǎn)甲烷細菌一樣，
具有既不同其他細菌也不同于其核生物的序列特征，而它們之間則具有許多共同的序列特征。
于是提出將生物分成為三界(Kingdom)(后來改稱三個域)：古細菌、真細菌(
Eubacteria)和真核生物(Eukaryotes)。1990年，他為了避免把古細菌也看作是細菌的一類
，他又把三界(域)改稱為：Bacteria(細菌)、Archaea(古生菌)和Eukarya(真核生物)。并構(gòu)建了三界(域)生物的系統(tǒng)樹。
四、微生物特點
生命基本特征：
生命通過它的耐久性、適應(yīng)性、它的生長及修復(fù)的能力和它的繁殖而延續(xù)下去，這是生命的基本的和普遍的特征。
新陳代謝，包括外部的和內(nèi)部的，是一切生命的另一基本特征。
控制與調(diào)節(jié)，是生命的又一基本特征。
體積小、比表面積大
大小以um計，但比表面積（表面積/體積）大，（插入表），必然有一個巨大的營養(yǎng)吸收，代謝廢物排泄和環(huán)境信息接受面。
這一特點也是微生物與一切大型生物相區(qū)別的關(guān)鍵所在。
特點1舉例
乳酸桿菌：120，000
雞蛋：1.5
人（200磅）：0.3
2、吸收多、轉(zhuǎn)化快
這一特性為高速生長繁殖和產(chǎn)生大量代謝物提供了充分的物質(zhì)基礎(chǔ)。
特點2舉例
重量相同下：乳酸菌：1小時可分解其體 重1000至10000倍乳糖。
人：2.5×105 小時消耗自身體重1000倍乳糖。
3、生長旺、繁殖快
極高生長繁殖速度，如E. coli 20-30分鐘分裂一次，若不停分裂，48小時2.2×1043
菌數(shù)增加，營養(yǎng)消耗，代謝積累，限制生長速度。
這一特性可在短時間內(nèi)把大量基質(zhì)轉(zhuǎn)化為有用產(chǎn)品，縮短科研周期。
也有不利一面，如疾病、糧食霉變。
4、適應(yīng)強、易變異
極其靈活適應(yīng)性，對極端環(huán)境具有驚人的適應(yīng)力。
遺傳物質(zhì)易變異。
5、分布廣、種類多
分布區(qū)域廣，分布環(huán)境廣。
生理代謝類型多，代謝產(chǎn)物種類多，種數(shù)多。
五、微生物作用
1、在自然界物質(zhì)循環(huán)中作用
2、空氣與水凈化，污水處理
3、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)：菌體，代謝產(chǎn)物，代謝活動
4、對生命科學(xué)的貢獻
六、分支學(xué)科
根據(jù)不同研究領(lǐng)域和不同研究對象劃分
第二節(jié)、微生物學(xué)發(fā)展簡史
"科學(xué)的歷史就是科學(xué)本身。"-- 歌德
中國古代
酒文化，"儀狄作酒，禹飲而甘之。"《書經(jīng)》"若作酒醴，爾惟曲蘗（nie）"《齊民要術(shù)》提倡輪作制。
宋真宗時代（公元998-1022
二、國外微生物學(xué)發(fā)展
1、微生物的發(fā)現(xiàn)--形態(tài)學(xué)時期
Antony Van Leeuwenhock，1632-1723
第一個報告自己觀察的人。他觀察了幾乎每一個想看到的東西，雨水、污水、血液、體液、酒、醋、牙垢等，發(fā)現(xiàn)了微生物，稱為"微動體"。
2、微生物學(xué)的奠基--生理學(xué)時期
Louis Pasteur，1822-1895
他的一生給人類生活帶來了史無前例的影響。
（1）證實了微生物活動和否定了微生物自然發(fā)生學(xué)說。
（2）免疫學(xué)--預(yù)防種痘
（3）發(fā)酵的研究
（4）其他貢獻
否定自生說
關(guān)于自然發(fā)生的爭論：
自然發(fā)生說（無生源說）：認為微小動物是從無生命的物質(zhì)自然發(fā)生的。
生源說：認為微小動物是從微小動物的"種子"或"胚"形成的，"種子"或"胚"存在于空氣中。
已進行的實驗：1665年，F(xiàn)racesco Redi 腐肉生蛆實驗，否定了動物自生說。
Spallanzani實驗，充分加熱的有機汁液中長出微生物原因是由于空氣將微生物帶進了汁液，因而采取完全密封隔絕的封閉法。
18世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)o2 ，意識到o2 是動物生活必需一種氣體。
Pasteur實驗
1、首先驗證了空氣中確實含有顯微鏡可觀察到的"有機體"。
2、加熱過的空氣通入汁液（煮沸過）并不導(dǎo)致微生物生長。
3、在一封閉容器內(nèi)，對完全滅菌的汁液加上一些收集到的微生物，無例外地引起微生物生長。
4、設(shè)計鵝頸瓶進行實驗，最終否定自生說。
免疫學(xué)貢獻
Edward Jenner，1796發(fā)明種痘，不了解機制。
Pasteur 1877研究了雞霍亂、炭疽病和恐水病，發(fā)現(xiàn)鈍化病原體可以誘發(fā)免疫性和預(yù)防疾病。
發(fā)酵研究
相信一切發(fā)酵作用都和微生物的存在及繁殖有關(guān)。不同的發(fā)酵是由不同的微生物引起的。
發(fā)明巴斯德消毒法。
觀察丁酸發(fā)酵時，發(fā)現(xiàn)厭氧生命，提出好氧、厭氧術(shù)語。
Robert Koch 1843-1910
1、建立微生物學(xué)研究基本技術(shù)
（1）分離和純化細菌：劃線法，混合倒平板法。瓊脂、培養(yǎng)皿（Petri）
（2）設(shè)計了培養(yǎng)細菌用的肉汁胨培養(yǎng)液和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。
（3）設(shè)計了細菌染色技術(shù)
2、證實疾病的病原菌學(xué)說，提出了柯赫準(zhǔn)則。
柯赫準(zhǔn)則
1、某一種微生物，當(dāng)被懷疑是病原體時，它一定伴隨著病害而存在。
2、必須能自原寄主分離出這種微生物，并培養(yǎng)成為純培養(yǎng)。
3、用已純化的純培養(yǎng)微生物，人工接種寄主，必須能誘發(fā)與原來病害相同病害。
4、必須自人工接種發(fā)病的寄主內(nèi)，能重新分離出同一病原微生物并培養(yǎng)成純培養(yǎng)。
其他人
Serge Winogradsky,1856-1953,發(fā)現(xiàn)微生物的自養(yǎng)生活。
Beijerinck M. W.,1851-1931，發(fā)現(xiàn)了非共生固氮菌。
Joseph Lister,1864,提出無菌外科操作技術(shù)。
Elie Metchnikoff 發(fā)現(xiàn)白細胞的吞噬作用。
Ivanovsky 發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒。
P. Ehrlich 現(xiàn)代化療的開始
3、現(xiàn)代微生物學(xué)發(fā)展-分子生物學(xué)階段
1、現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的形成：1941，F(xiàn)lorey & Chain
將青霉素投入生產(chǎn)，是通氣培養(yǎng)微生物的開端，將微生物學(xué)與工程學(xué)結(jié)合。
2、微生物代謝作用研究；
1944，Avery 肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗，確定DNA是遺傳物質(zhì)，標(biāo)志著分子生物學(xué)的形成。
1953，Watson & Crick 提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以及半保留復(fù)制假說。
3、分子生物學(xué)階段
20世紀(jì)70年代，基因工程的發(fā)展，工程菌的構(gòu)建更促進了微生物學(xué)的發(fā)展。
微生物學(xué)推動生命科學(xué)的發(fā)展
促進許多重大理論問題的突破
對生命科學(xué)研究技術(shù)的貢獻
與"人類基因組計劃"
展望
3節(jié)：工業(yè)微生物...
3節(jié)：工業(yè)微生物簡介
1、釀酒工業(yè)
白酒：四大名酒，五大香型
啤酒、黃酒、葡萄酒（威士忌、白蘭地、伏特加、朗姆、金酒）
2、酒精工業(yè)
3、溶劑工業(yè)（丙酮、丁醇）
4、有機酸工業(yè): 乳酸、檸檬酸、衣康酸、延胡索酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸等。
5、抗生素工業(yè)
6、酶制劑工業(yè)
7、氨基酸工業(yè)
8、酵母工業(yè)
9、多糖工業(yè)：黃原膠、右旋糖苷、等等
10、石油發(fā)酵
11、生物活性物質(zhì)：核酸類、維生素等
12、其它：微生物農(nóng)藥、沼氣發(fā)酵、生物制品（菌苗、疫苗）
4節(jié)：微生物分類 Microbial taxonomy
分類主要是探索生物之間的親緣關(guān)系，把它們歸納為互相聯(lián)系的不同類群。
具體任務(wù)就是分類、鑒定和命名。
一、分類單位與命名
（一）分類單位:
界,門,綱,目,科,屬,種
種是最基本的分類單位,它是一大群表型特征高度相似，親緣關(guān)系極其相近，與同屬內(nèi)其它種有著明顯差異的菌株的總稱。
種以下又分亞種(變種),型,類群,菌株(品系)
菌株(品系)(strain): 表示任何由一個獨立分離的單細胞繁殖成的純種群體及其一切后代。
（二）命名
命名按照《國際細菌命名法規(guī)》,采用林奈氏雙名法。
屬名 + 種名 +命名人
如大腸桿菌: Escherichia coli (Migula) Castellani & Chalmers 1919
屬名:名詞,大寫首字母,一般描繪主要形態(tài)或生理特征。
種名:形容詞,小寫,代表一個種次要特征。
未確定種名或不指特定的種時，可在屬名后加sp.表示。
舉例
真菌界 Fungi
真菌門 Eumycophyta
子囊菌綱 Ascomycetes
原子囊亞綱 Protoascomycetes
內(nèi)孢霉目 Endomycetales
內(nèi)孢霉科 Endomycetaceae
酵母亞科 Sacchromycetoideae
酵母屬 Sacchromyces
釀酒酵母 S. cerevisiae Hansen
二、分類依據(jù)
1、形態(tài)特征（個體和群體）
細胞形態(tài)：形狀、大小、排列、染色反應(yīng)等。
培養(yǎng)：固體- 菌落，半固體- 穿刺，液體。
2、生理生化反應(yīng)
營養(yǎng)要求：碳源、氮源、營養(yǎng)類型
代謝產(chǎn)物：種類、產(chǎn)量、顯色反應(yīng)
酶：產(chǎn)酶種類、反應(yīng)特性
3、生態(tài)學(xué)特征
相互關(guān)系、宿主種類、與氧關(guān)系等。
4、生活史
5、血清學(xué)反應(yīng)
近年又發(fā)展了紅外光譜，GC含量，DNA雜交等。
三、分類方法
（一）經(jīng)典分類法
隨機地和不系統(tǒng)地根據(jù)一些特征進行分類。主要是形態(tài)、生理生化特征。
（二）數(shù)值分類法
根據(jù)較多特征分類，每一特征地位相同。
1、每一菌株為一操作單位，確定很多特征（50-60 個）
2、比較菌株間的最大相似性
陽性和陰性符合的總和
---------------------------------× 100%
總的測定數(shù) --- 無效測定數(shù)
>85%為同種，>65%為同屬
3、據(jù)數(shù)值繪出矩陣圖并轉(zhuǎn)換成樹狀譜。
（三）分子與遺傳方法
1、DNA堿基組成：GC%
相同不能說明是同種，但不同則肯定不是同種。
差別>10%不是同種，<10%可能是同種。
2、核酸分子雜交
比較堿基順序的同源性
3、16s rRNA寡核苷酸編目分析
水解rRNA產(chǎn)生一系列寡核苷酸片段，順序分析。
近年來，采用紅外、核磁、電鏡等新技術(shù)越來越廣泛。
四、分類系統(tǒng)
原核生物：
《伯杰氏細菌鑒定手冊》第8版，1973
《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》第9版，1984
真菌：Ainsworth (1973)系統(tǒng)
酵母：Lodder分類系統(tǒng)
菌種鑒定工作三部曲
1、獲得該微生物的純培養(yǎng)
2、測定一系列必要的鑒定指標(biāo)
3、查找權(quán)威性鑒定手冊
一章：微生物類群與形態(tài)結(jié)構(gòu)
非細胞型：病毒
細胞型：原核微生物：細菌、放線菌等，
無明顯核，也無核膜、核仁。
真核微生物：酵母菌、霉菌，
有明顯核，有核膜、核仁。
1節(jié)：細菌 Bacteria
是微生物一大類群，主要研究對象。
細菌是單細胞的，大小在1um左右，1000倍以上顯微鏡才能看到其形狀。
一、細菌的形態(tài)和大小
（一）基本形態(tài)
1、球菌
Coccus：球形或近球形，根據(jù)空間排列方式不同又分為單、雙、鏈、四聯(lián)、八疊、葡萄球菌。不同的排列方式是由于細胞分裂方向及分裂后情況不同造成的。
2、桿菌 Bacillus (Bacterium)：桿狀或圓柱形，徑長比不同，短粗或細長。是細菌中種類最多的。
3、螺旋菌
Spirillum：是細胞呈彎曲桿狀細菌統(tǒng)稱，一般分散存在。根據(jù)其長度、螺旋數(shù)目和螺距等差別，分為弧菌Vibrio（菌體只有一個彎曲，形似C字）和螺旋菌（螺旋狀，超過1圈）。
與螺旋體 Spirochaeta 區(qū)別：無鞭毛。
細菌形態(tài)不是一成不變的，受環(huán)境條件影響（如溫度、培養(yǎng)基濃度及組成、菌齡等）
異常形態(tài)
一般，幼齡，生長條件適宜，形狀正常、整齊。老齡，不正常，異常形態(tài)。
畸形：由于理化因素刺激，阻礙細胞發(fā)育引起。
衰頹形：由于培養(yǎng)時間長，細胞衰老，營養(yǎng)缺乏，或排泄物積累過多引起。
（二）細菌大小
如何測量：顯微測微尺
球菌直徑0.5-1um
桿菌直徑0.5-1um ，長為直徑1-幾倍
螺旋菌直徑03-1um，長1-50um
細菌大小也不是一成不變的。
細胞重量10-13-10-12g ，每g細菌
二、細菌細胞結(jié)構(gòu)
研究細菌細胞結(jié)構(gòu)是分子生物學(xué)重要內(nèi)容之一，有了電子顯微鏡才有可能。
其結(jié)構(gòu)分為基本結(jié)構(gòu)和特殊結(jié)構(gòu)。
基本結(jié)構(gòu)是細胞不變部分，每個細胞都有，如細胞壁、膜、核。
特殊結(jié)構(gòu)是細胞可變部分，不是每個都有，如鞭毛、莢膜、芽孢。
（一）基本結(jié)構(gòu)
1、細胞壁 cell wall：位于細胞表面，較堅硬，略具彈性結(jié)構(gòu)。
功能：1）維持細胞外形；2）保護細胞免受機械損傷和滲透壓危害；3）鞭毛運動支點；4）正常細胞分裂必需；5）一定的屏障作用；6）噬菌體受體位點所在。另外與細菌的抗原性、致病性有關(guān)。
革蘭氏染色
Cristein Gram，1884發(fā)明（Koch實驗室）
染色過程：(插入）
凡是不能被乙醇脫色，呈藍紫色，稱為革蘭氏陽性菌 G+
凡是經(jīng)乙醇脫色，呈復(fù)染劑顏色，稱為革蘭氏陰性菌 G-
結(jié)果不同主要是細胞壁組成及結(jié)構(gòu)差異造成的。
（1）革蘭氏陽性菌 Gram positive
以金黃色葡萄球菌為例，Staphylococcus aureus
細胞壁構(gòu)成：一連續(xù)層，厚20-80nm
兩部分：網(wǎng)狀骨架：微纖絲組成
基質(zhì)：骨架埋于基質(zhì)中
化學(xué)組成：主要是肽聚糖和磷壁酸
肽聚糖 peptidoglycan (粘肽、胞壁質(zhì)）
大分子復(fù)合體，許多亞單位交聯(lián)而成。
亞單位
1）雙糖單位：N-乙酰胞壁酸（NAM）和N-乙酰葡萄糖胺（NAG）通過â-1，4糖苷鍵相連而成。
2）短肽：L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala
3) 肽橋：短肽之間連接。
短肽全部或部分連至NAM上，短肽之間也有連接，組成一網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
肽聚糖是細菌細胞壁特有成分，也是原核微生物特有成分（古生菌沒有）
磷壁酸 teichoic acid (垣酸）
G+特有成分。
多元醇與磷酸復(fù)合物，通過磷酸二酯鍵與NAM相連。
根據(jù)多元醇不同，有甘油型、核糖醇型等5種類型。
主要功能：使壁形成負電荷環(huán)境，吸附二價金屬離子，維持壁硬度和一些酶活性。還可提供噬菌體位點。
（2）革蘭氏陰性菌 Gram negative
以大腸桿菌為例：
內(nèi)壁層：厚2-3 nm，單（雙）分子層，由肽聚糖構(gòu)成。
與G+區(qū)別：交聯(lián)低；DAP取代 L-Lys；肽橋。
外壁層：內(nèi)層：脂蛋白層，以脂類部分與肽聚糖相連。中層：磷脂層。外層：脂多糖層，外壁重要成分，8-10 nm。
脂多糖 lipopolysaccharide LPS
G-特有成分。
結(jié)構(gòu)：類脂A + 核心多糖 + O-側(cè)鏈
功能：1）內(nèi)毒素物質(zhì)基礎(chǔ)；2）吸附鎂、鈣離子；3）決定G-表面抗原；4）噬菌體受體位點。
鈣離子是維持LPS穩(wěn)定性所必需的。
D-AA存在優(yōu)點
G+與G-比較
革蘭氏染色機制
在細胞壁與細胞膜之間，有周質(zhì)空間（隙），含水解酶、載體蛋白等。
（3）細胞壁缺陷細菌
1、原生質(zhì)體protoplast：人工條件下用溶菌酶除去細胞壁或用青霉素抑制細胞壁合成后，所留下的部分。一般由G+形成。
2、球形體spheroplast：殘留部分細胞壁，一般由G-形成。有一定抗性。
特點：對滲透壓敏感；長鞭毛也不運動；對噬菌體不敏感；細胞不能分裂等。
3、細菌 L型：一種由自發(fā)突變形成的變異型，無完整細胞壁，在固體培養(yǎng)基表面形成 "油煎蛋 "狀小菌落。
4、支原體：長期進化形成。
2、細胞膜 cell membrane
在細胞壁與細胞質(zhì)之間的一層柔軟而富有彈性的半透性膜。厚7-8nm。
化學(xué)組成：蛋白和磷脂，蛋白含量高達75%，種類也多。膜不含甾醇類。
膜結(jié)構(gòu)（插入）
功能：1）高度選擇透性膜，物質(zhì)運輸：2）滲透屏障，維持正常滲透壓；3）重要代謝活動中心；4）與壁、莢膜合成有關(guān)；5）鞭毛著生點，供運動能量。
3、間體 mesosome(中質(zhì)體）
細胞膜內(nèi)陷形成。
功能：1）擬線粒體，呼吸酶系發(fā)達。
2）與壁合成，核分裂，芽孢形成有關(guān)。
4、細胞核 nuclear body
核質(zhì)體
原核無明顯核，一反差弱的核區(qū)。
特點：無核膜、核仁、固定形態(tài)，結(jié)構(gòu)簡單，細胞分裂前核分裂。一般單倍體。
成分：DNA：環(huán)狀雙鏈，超線圈結(jié)構(gòu)，負電荷被鎂離子、有機堿（精胺、腐胺）所中和。
與真核區(qū)別：
5、核糖體 ribosome RS
核糖核蛋白的顆粒狀結(jié)構(gòu)，RNA+蛋白。
原核：游離態(tài)、多聚核糖體，70S
真核：游離態(tài)、結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，70、80S
多聚核糖體：一條mRNA與一定數(shù)目的單個RS結(jié)合而成。
功能：
6、細胞質(zhì)及內(nèi)含物
是無色透明膠狀物，原核與真核不同。
主要成分：水、蛋白、核酸、脂類及少量糖和無機鹽。富含核糖核酸。
不同細菌細胞內(nèi)，含不同內(nèi)含物，是細胞的貯藏物質(zhì)或代謝產(chǎn)物。（插入）
內(nèi)含物優(yōu)點？
（二）特殊結(jié)構(gòu)
1、莢膜 capsule：某些細菌細胞壁外面覆蓋著一層疏松透明粘性物質(zhì)。厚度不同，名稱不同。
折光率低，負染法觀察。
成分：90%以上為水，余為多糖（肽）。
功能：1）抵抗干燥；2）加強致病力，免受吞噬；3）堆積某些代謝廢物；4）貯存物。
2、鞭毛和菌毛
鞭毛flagellum：某些細菌表面一種纖細呈波狀的絲狀物，是細菌運動器官。
直徑20-25nm，長超過菌體若干倍。電鏡或特殊染色法觀察，懸滴法觀察運動。
化學(xué)成分：主要是蛋白質(zhì)。
結(jié)構(gòu)：G+與G-區(qū)別；原核與真核區(qū)別
鞭毛著生位置與數(shù)目，可作為分類依據(jù)。
鞭毛著生狀態(tài)決定運動特點。
趨性運動：栓菌實驗
菌毛fimbria (pilus )：許多G-尤其是腸道菌，表面有比鞭毛更細，數(shù)目多，短直硬的絲狀體。
直徑7-10nm ,長2-3um。
性菌毛（F菌毛）
3、芽孢 spore, endospore
某些菌生長一定階段，于營養(yǎng)細胞內(nèi)形成一個內(nèi)生孢子，是對不良有抗性的休眠體。
每一細胞僅形成一個芽孢，所以其沒有繁殖功能。
形成芽孢屬于細胞分化（形態(tài)發(fā)生）
Bacillus, clostridium, Spirillum, Vibrio, Sarcina
結(jié)構(gòu)組成特點：含水量低（平均40%），壁致密，芽孢肽聚糖和吡啶-2,6-二羧酸鈣（DPA-Ca ）
芽孢有極強的抗熱、輻射、化學(xué)藥物和靜水壓的能力，休眠力驚人。
芽孢結(jié)構(gòu)、形成、萌發(fā)（自學(xué)）
伴孢晶體
孢囊 cyst，等等。
三、細菌繁殖與群體形態(tài)
1、繁殖方式：裂殖為主，少數(shù)有性接合。
2、菌落形態(tài)：菌落colony：由單個或少數(shù)幾個細胞在固體培養(yǎng)基表面繁殖出來的，肉眼可見的子細胞群體。
形態(tài)包括大小、形狀、隆起、邊緣、表面狀態(tài)、表面光澤、質(zhì)地、顏色等等。
純培養(yǎng)：克隆clone
菌苔lawn
四、常見常用細菌
細胞結(jié)構(gòu)、菌落特點、代謝產(chǎn)物等。
2節(jié)：放線菌 Actinomycetes
因菌落呈放射狀而得名，是絲狀分枝細胞的細菌。
一般分布在含水量低，有機質(zhì)豐富的中性偏堿性土壤中，特殊土腥味。
大多數(shù)是腐生菌，少數(shù)寄生；多數(shù)異養(yǎng)，好氧。
突出特性是產(chǎn)各種抗生素。
一、形態(tài)與結(jié)構(gòu)
由菌絲構(gòu)成，直徑0.2-1.2um，無橫隔，仍是單細胞。
菌絲分為：基內(nèi)菌絲（營養(yǎng)菌絲）
氣生菌絲
孢子絲
菌絲組成菌落，分為兩類。
放線菌仍是原核微生物？
二、繁殖
以無性孢子為主，菌絲斷裂片段也可繁殖成新菌體。
孢子形成方式：橫隔分裂
孢囊孢子
放線菌生活史（發(fā)育周期）
三、代表屬及常見菌
（一）鏈霉菌屬 Streptomyces
90%抗生素，菌絲發(fā)育良好。如龜裂鏈霉菌S. rimosus, 灰色鏈霉菌S. griseus
(二）小單孢菌屬Micromonospora
無氣生菌絲，基內(nèi)菌絲頂端著生一孢子。
（三）諾卡氏菌Nocardia
原放線菌屬，降解能力強。
（四）放線菌屬Actinomyces
只有基內(nèi)菌絲，不形成孢子，厭氧。
（五）鏈孢囊菌屬Streptosporangium
形成孢子囊，孢囊孢子。
放線菌、細菌異同？
3節(jié)：其它幾類原核微生物
重要了解大小、G、培養(yǎng)、細胞及代謝。
一、立克次氏體
Rickettsia：介于細菌、病毒之間，專性真核活細胞內(nèi)寄生，不能人工培養(yǎng)。不濾過，直徑0.3-0.6um，存在與寄主細胞質(zhì)和核中。細胞球狀或桿狀，不運動。G-，膜疏松，酶系統(tǒng)不完全，不完整的產(chǎn)能代謝，抵抗性差。
二、支原體Mycoplasma：介于細菌、立克次氏體之間。不具細胞壁，細胞膜含甾醇類。G-，直徑0.2-0.25um，可濾過。已知可獨立生活的最小的細胞型生物�？扇斯づ囵B(yǎng)，營養(yǎng)要求苛刻，油煎蛋菌落。
三、衣原體Chlamydia：介于立克次氏體、病毒之間�？蔀V過，專性活細胞內(nèi)寄生。G-，"能量寄生物 "。
各類原核微生物與病毒比較表。
藍細菌Cyanobacteria：含葉綠素，進行放氧型光合作用的原核生物。由于抵抗力和固氮能力，可在貧瘠沙灘荒巖上生長，稱為
"先鋒生物 "。
蛭弧菌Bdellovibrio：寄生于其他細菌并導(dǎo)致裂解，可濾過，運動活躍，G-。生物防治。
4節(jié)：酵母菌 yeast
非分類名詞，一群單細胞微生物，屬真菌類。第一種 "家養(yǎng)微生物 "，與人類關(guān)系密切。主要分布在含糖較高偏酸性環(huán)境中，又稱
"糖真菌 "。
一、形態(tài)大小...
一、形態(tài)大小
單細胞，無鞭毛。細胞形態(tài)多樣，常見球、卵、圓桶形。
大小在1-5um X 5-30um之間。
二、細胞結(jié)構(gòu)
1、細胞壁：厚0.1-0.3um，三層，由酵母纖維素組成（甘露聚糖、葡聚糖、蛋白、類脂）。用蝸牛酶（heliase）破壞壁來制備原生質(zhì)體。
2、細胞膜：與原核基本相同，但含甾醇（麥角固醇）。由于有細胞器分化，功能不及細菌多，主要是調(diào)節(jié)滲透壓、吸收營養(yǎng)、分泌代謝物等
3、細胞質(zhì)及內(nèi)含物
4、細胞核：真核：雙層單位膜，大量核孔，可見染色體，一個或幾個核仁，核膜外有中心體。
5、線粒體：含有一環(huán)狀DNA。呼吸酶系載體， "動力工廠 "。有氧時需要，厭氧或過量葡萄糖存在時，被阻遏。
環(huán)狀 "2um質(zhì)粒 "：外源DNA載體。
6、核糖體：細胞質(zhì)中80S，線粒體70S。
三、菌落特征
與細菌相似，但大且厚。
四、繁殖方式與生活史
（一）繁殖方式
1、無性繁殖
(1)芽殖 budding：最普遍方式（過程）
(2)裂殖 fission：少數(shù)（裂殖酵母）
(3)無性孢子：節(jié)孢子、擲孢子、厚垣孢子。
2、有性繁殖
產(chǎn)生子囊和子囊孢子。過程：質(zhì)配--核配--減數(shù)分裂
3、形成孢子條件
營養(yǎng)充足強壯幼齡細胞
適當(dāng)溫、濕度（25-30，80%）
空氣要流通
適當(dāng)?shù)纳咦优囵B(yǎng)基
（二）生活史 life history(life cycle)
某種生物在整個發(fā)育階段，有一個或幾個同形或不同形的個體前后相繼形成一個有規(guī)律的循環(huán)。
四種基本類型：
1、無生殖，僅有營養(yǎng)繁殖。（細菌）
2、僅有一個單倍體生活，雙倍體短。
3、僅有一個雙倍體生活，單倍體短。
4、有世代交替現(xiàn)象，單倍體有性，雙倍體無性。
酵母菌有三種類型：
單倍體型：八孢裂殖酵母
雙倍體型：路德類酵母
世代交替型：釀酒酵母
五、常見常用酵母菌
酵母圖示
5節(jié)：霉菌 molds
非分類名詞，絲狀真菌統(tǒng)稱。通常指菌絲體發(fā)達而又不產(chǎn)生大型子實體的真菌。
一、形態(tài)和構(gòu)造
營養(yǎng)體由菌絲（hyphae)構(gòu)成，直徑3-10um，菌絲再形成菌絲體（mycelium）
菌絲：無隔，多核單細胞，低等真菌
有隔，多細胞，高等真菌
菌絲體：營養(yǎng)菌絲，伸入培養(yǎng)基吸收營養(yǎng)
氣生菌絲，向空中生成，形成繁殖器官。（特化形式）
細胞壁厚100-250nm，多含幾丁質(zhì)。
不同類型真菌壁成分比較
二、繁殖與生活史
（一）繁殖
1、無性孢子：主要方式，特點是分散，數(shù)量大。
孢囊孢子：內(nèi)生孢子，毛、根、犁頭霉
分生孢子：外生孢子，最普遍
節(jié)孢子：粉孢子，菌絲斷裂形成
厚垣孢子：真菌休眠體
2、有性孢子
卵孢子：配子囊（雄器、藏卵器）
接合孢子：同宗、異宗配合
子囊孢子：形態(tài)多樣。子實體、子囊果
擔(dān)孢子：擔(dān)子菌特征
（二）生活史
霉菌指從一種孢子開始，經(jīng)過一定的生長和發(fā)育，最后又形成同一種孢子為止。
三、菌落
疏松，絨毛狀、絮狀、蛛網(wǎng)狀。
四大類微生物比較：
四、分類
過去依據(jù)菌絲體及有性繁殖特征分為三綱一類，藻狀菌綱、子囊菌綱、擔(dān)子菌綱、半知菌類。
Ainsworth 分類系統(tǒng)：
五、常見常用霉菌
中國食用和藥用大型真菌
(一)食用真菌
1、種類資源：擔(dān)子菌675種，子囊菌45種。通常栽培的僅10多種。
2、營養(yǎng)：蛋白含量高，AA多達18種左右，特別是人體必需AA。還含有多種維生素、糖類和礦物質(zhì)。Lys含量一般較高。
3、栽培：發(fā)展栽培同時，重視采用菌絲體的深層培養(yǎng)，特別是風(fēng)味特殊而鮮美的種類。菌絲體培養(yǎng)物可新鮮食用，或冷凍干燥成粉，制成食品。
目前栽培廣而產(chǎn)而產(chǎn)量大的品種：雙孢菇、大肥菇、香菇、草菇、金針菇、側(cè)耳（平菇）、鳳尾側(cè)耳、滑菇、銀耳、木耳、猴頭菌、長裙竹蓀等。
培養(yǎng)料來源多且廣，棉子殼、鋸末、秸桿、蔗渣、酒糟等。
4、應(yīng)用：食用子實體、菌絲體深層培養(yǎng)。作調(diào)味品、香味、飲料等。
（二）藥用真菌
1、資源：擔(dān)子菌345種，子囊菌28種，其它11種。
2、應(yīng)用：有20多個方面，主要抗癌、抑菌。目前認為抗癌物質(zhì)主要是多糖，如香菇多糖、銀耳酸性異多糖、蕓芝多糖（PSK）、茯苓多糖、豬苓多糖、靈芝多糖等。
細胞型生物小結(jié)
真菌、細菌、放線菌比較：
真核、原核區(qū)別：
6節(jié)：病毒 virus
非細胞型生物，有區(qū)別于細胞型特征：
1、形體十分微小，濾過，電鏡可見；
2、無細胞結(jié)構(gòu)，分子生物，由核酸和蛋白組成，且一種病毒僅含一種類型核酸；
3、專性活細胞內(nèi)寄生，有宿主專一性，無獨立代謝酶系，依賴宿主自身復(fù)制；
4、對抗生素不敏感，對干擾素敏感。
概念：病毒是超顯微的，無細胞結(jié)構(gòu)，專性活細胞內(nèi)寄生，在活細胞外具一般化學(xué)大分子特征，一旦進入宿主細胞又具有生命特征。
根據(jù)宿主不同，可把病毒分為幾類，如動物病毒、植物病毒、昆蟲病毒、細菌病毒等。
病毒的核酸與細胞型也不同。
一、形態(tài)、結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成
1、大小：nm, 多在100nm左右。圖片
2、病毒粒子 virion (病毒顆粒）
成分：核酸--核心core 核衣殼
蛋白--衣殼capsid nucleocapsid
衣殼粒 capsomere
包膜（類脂或脂蛋白）envelope
病毒粒子對稱體制：螺旋對稱（TMV）
廿面體對稱（腺病毒）
功能：核酸：遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)
蛋白：構(gòu)成外殼，保護病毒免受核酸酶及其它因子破壞；決定感染特異性；決定抗原性。
3、噬菌體 phage：多為蝌蚪狀，結(jié)構(gòu)模式圖。頭部為廿面體對稱，尾部為螺旋對稱。
4、群體形態(tài)：病毒包涵體、噬菌斑
二、繁殖（烈性噬菌體為例）
1、吸附：分兩階段。感染復(fù)數(shù)m.o.i
2、侵入：頭部DNA通過尾管注入至細胞中，外殼留在胞外。自外裂解
3、增殖：包括DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成。雙鏈DNA噬菌體三階段轉(zhuǎn)錄：
遺傳信息轉(zhuǎn)移：
4、成熟（裝配）：潛伏期
5、裂解（釋放）：裂解期
上述烈性噬菌體的生長方式，稱為一步生長。
一步生長曲線：
裂解量：每個被感染的細菌釋放新的噬菌體的平均數(shù)。
三、噬菌體與宿主關(guān)系
1、烈性噬菌體：凡能引起宿主細胞迅速裂解的噬菌體。敏感細菌。
2、溫和性噬菌體：噬菌體侵染宿主后，并不增殖，裂解，而與宿主DNA結(jié)合，隨宿主DNA復(fù)制而復(fù)制，此時細胞中找不到形態(tài)上可見的噬菌體，這種噬菌體稱為溫和性噬菌體。含有溫和性噬菌體的細菌稱為溶源性細菌lysogenic
bacteria
溫和性噬菌體存在狀態(tài)
1）游離具感染性的virion；
2）前噬菌體（prophage）：附著或整合在宿主染色體上，一道復(fù)制；
3）營養(yǎng)期噬菌體：指導(dǎo)合成。
3、溶源性細菌特性
1）遺傳性
2）自發(fā)裂解
3）誘發(fā)裂解：雙氧水、UV、X、等。
4）免疫性
5）復(fù)愈（消失溶源性）
6）溶源轉(zhuǎn)變
溶源性菌株命名
四、噬菌體分離檢查與防治
（一）分離檢查（效價測定）
怎樣證實有噬菌體存在：宿主特異性；噬菌斑、液體培養(yǎng)變清等。
1、雙層平板法
2、單層平板法
3、玻片快速法
效價（titre），噬菌斑形成單位（pfu）
（二）防治措施
1、消滅phage，杜絕其依賴生存條件。
2、選育和使用抗phage菌株。
3、菌種輪換使用。
4、藥物防治：加入某些金屬螯合劑、表面活性劑。
五、亞病毒
1、類病毒viroid：沒有衣殼包裹的RNA分子。
2、擬病毒virusoids(類類病毒）：一類包括在植物病毒粒子中的類病毒，RNA。
3、朊病毒prion, virino：一類能侵染動物并在宿主細胞內(nèi)復(fù)制的小分子無免疫性的疏水性蛋白。
艾滋病
AIDS 獲得性免疫缺陷綜合征
1981年首先在USA發(fā)現(xiàn)，1983年巴斯德研究所宣布分離出一種virus證實為AIDS的病原，1986年WHO定名為人類免疫缺陷病毒（HIV）。
HIV專門侵犯淋巴細胞，造成免疫缺陷。
傳播途徑：血液、母嬰、體液
第二章：微生物營養(yǎng)和培養(yǎng)基
了解不同微生物需要什么營養(yǎng)物，怎樣吸收，起什么作用，如何為其配餐。
營養(yǎng)物：必須得到的細胞結(jié)構(gòu) 成分，必須得到的能量儲存物質(zhì)。
營養(yǎng)：把營養(yǎng)物從外界吸收至細胞內(nèi)，復(fù)制出新細胞結(jié)構(gòu)的過程。
1節(jié)：營養(yǎng)物及其功能
一、細胞化學(xué)組成
整個生物界大體相同，主要是C、H、O、N（占干重90-97%），C（約50%），此外為各種無機元素，由這些元素再組成化合物。其中C/N一般是5:1。
1、水分和無機元素
含水70-90%（鮮重），無機元素（3-10%干重）依次為P、S、K、Mg、 Ca、Fe、Zn、Mn等。
2、有機物
蛋白質(zhì),核酸,碳水化合物,類脂,維生素等
二、主要營養(yǎng)物及其功能
主要功能：提供合成原生質(zhì)和代謝產(chǎn)物原料；產(chǎn)生合成反應(yīng)及生命活動所需能量；調(diào)節(jié)新陳代謝。
（一）碳源物質(zhì)
定義：凡能提供微生物營養(yǎng)所需碳元素的營養(yǎng)源。
功能：碳源、能源
微生物碳源譜：
（二）氮源物質(zhì)
定義：凡能提供微生物營養(yǎng)所需氮元素的營養(yǎng)源。
功能：氮源，一般不作能源。
微生物氮源譜：
氨基酸自養(yǎng)型和異養(yǎng)型生物
速效氮源和遲效氮源
生理堿性、酸性、中性鹽
（三）能源
化學(xué)能：有機物-化能異養(yǎng)微生物
無機物 -化能自養(yǎng)微生物
光能
（四）生長因子
定義：一類對微生物正常代謝必不可少且又不能從簡單的碳、氮源自行合成的所需極微量的有機物。
種類：維生素、AA、base、FA等。
作用：輔酶或酶活化
來源：酵母膏、玉米漿、麥芽汁等，復(fù)合維生素。
濃度：
（五）無機鹽
所需濃度在10-3-10-4M的元素為大量元素
所需濃度在10-6-10-8M為微量元素。
主要功能：構(gòu)成菌體成分；酶活性基組成或維持酶活性；調(diào)節(jié)滲透壓、pH、Eh；化能自養(yǎng)微生物能源等。
無機元素來源與功能：
一些無機元素加入鹽：
（六）水
存在狀態(tài)：游離態(tài)（溶媒）和結(jié)合態(tài)（結(jié)構(gòu)組成）
生理作用：組成成分；反應(yīng)介質(zhì)；物質(zhì)運輸媒體；熱的良導(dǎo)體。
2節(jié)：微生物營養(yǎng)類型
依碳源不同：
異養(yǎng)型heterotrophs（不能以CO2為主要或唯一碳源。
自養(yǎng)型autotrophs（能以CO2為主要或唯一碳源。
依能源不同：
光能營養(yǎng)型phototrophs（光反應(yīng)產(chǎn)能）
化能營養(yǎng)型chemotrophs （物質(zhì)氧化產(chǎn)能）
這樣可將微生物分成四種營養(yǎng)類型
（插入）
其中，化能異養(yǎng)型又據(jù)利用有機物特性，分成腐生和寄生。
營養(yǎng)類型劃分不是絕對的，不同生活條件下，可相互轉(zhuǎn)變。
3節(jié)：營養(yǎng)物吸收與代謝物分泌
營養(yǎng)物吸收至胞內(nèi)被利用，代謝物分泌到胞外以免積累，這就是物質(zhì)運輸過程。
通透性與吸收是不同概念。
一般 大分子：先水解為小分子，再吸收。
脂溶性物質(zhì)：易透過
離子化合物：弱快強慢（極性）
一、營養(yǎng)物吸收
1、單純擴散 simple diffusion
依靠胞內(nèi)外溶液濃度差，順濃度梯度運輸，不消耗代謝能，無特異性。水、二氧化碳、氧氣、甘油、乙醇等。
2、促進擴散 facilitated diffusion
借助載體蛋白順濃度梯度運輸，不耗能，有特異性。載體蛋白（滲透酶）有底物特異性，是誘導(dǎo)產(chǎn)生的。硫酸根、磷酸根、糖（真核）
3、主動運輸 active transport
吸收營養(yǎng)物的主要機制。
逆濃度梯度運輸，耗能，需載體蛋白，有特異性。氨基酸、乳糖等糖類、鈉、鈣等無機離子。
親和力改變←蛋白構(gòu)象改變→耗能
上述3種方式中，被運輸?shù)娜苜|(zhì)分子都不發(fā)生改變。
4、基團轉(zhuǎn)位 group translocation
屬主動運輸，但溶質(zhì)分子發(fā)生化學(xué)修飾-定向磷酸化。主要依賴磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）。
PEP+ HPr<=>丙酮酸+P-HPr (EI)
糖+P-HPr<=>糖-P+HPr (EII)
膜對大多數(shù)磷酸化合物具有高度的不滲透性。葡萄糖、果糖、甘露糖、嘌呤、核苷、脂肪酸等。
二、代謝物分泌
微生物能分泌多種物質(zhì)，如有機酸、糖類、胞外酶、莢膜多糖等，由此可知，分泌與吸收不是同一機制。
4節(jié)：培養(yǎng)基 medium
選用各種營養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)人工配制用來培養(yǎng)微生物的基質(zhì)。
一、培養(yǎng)基類型
1、依來源不同：合成、天然、半合成。
2、依狀態(tài)不同：固體、半固體、液體。
3、依功能不同：選擇、鑒別
二、選擇和配制培養(yǎng)基的原則和方法
（一）四個原則
1、目的明確
培養(yǎng)什么微生物，獲得什么產(chǎn)物，用途
2、營養(yǎng)協(xié)調(diào)
恰當(dāng)配比，尤其是C/N比（100/0.5-2）
3、物理化學(xué)條件適宜
pH，考慮區(qū)別，培養(yǎng)基調(diào)節(jié)能力。采用磷酸緩沖液或假如碳酸鈣，流加酸堿。
滲透壓和水活度 aw : 等滲適宜。
aw表示在天然環(huán)境中，微生物可實際利用的自由水或游離水含量。微生物適宜生長的aw為0.6-0.998之間。氧化還原電位Eh：好氧微生物+0.1v以上；兼性厭氧+0.1v以上行好氧呼吸，
+0.1v以下行發(fā)酵；厭氧微生物+0.1v以下生長。
4、經(jīng)濟節(jié)約
以粗代精、以廢代好、以簡代繁等。
（二）四種方法
1、生態(tài)模擬
2、查閱文獻
3、精心設(shè)計
4、實驗比較
第三章：微生物代謝
廣義的代謝--生命體進行的一切化學(xué)反應(yīng)。
代謝分為能量代謝和物質(zhì)代謝，分解代謝和合成代謝。
分解代謝：復(fù)雜營養(yǎng)物分解為簡單化合物（異化作用）。
合成代謝：簡單小分子合成為復(fù)雜大分子（同化作用）
二者關(guān)系
初級和次級代謝
依據(jù)代謝產(chǎn)物在微生物中作用不同，又有初級代謝和次級代謝。
初級代謝：能使?fàn)I養(yǎng)物轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)物質(zhì)、具生理活性物質(zhì)或提供生長能量的一類代謝。產(chǎn)物有小分子前體物、單體、多聚體等生命必需物質(zhì)。
次級代謝：某些微生物中并在一定生長時期出現(xiàn)的一類代謝。產(chǎn)物有抗生素、酶抑制劑、毒素、甾體化合物等，與生命活動無關(guān)，不參與細胞結(jié)構(gòu)，也不是酶活性必需，但對人類有用。
二者關(guān)系：先初后次，初級形成期也是生長期，只有大量生長，才能積累產(chǎn)物。
1節(jié)：微生物能量代謝
微生物對能量利用：
有機物 化能異養(yǎng)菌
日光 光能營養(yǎng)菌 通用能源
還原態(tài)無機物 化能自養(yǎng)菌 ATP
只有ATP和酰基輔酶A起偶聯(lián)作用，其他高能化合物只作為?P供體。
生物氧化過程分為：脫氫、遞氫、受氫三個階段。
生物氧化功能：產(chǎn)能（ATP）、產(chǎn)還原力[H]、產(chǎn)小分子中間代謝物。
以下主要講述化能異養(yǎng)微生物的生物氧化和產(chǎn)能。
一、底物（基質(zhì)）脫氫的四條主要途徑
以葡萄糖作為典型底物
1、EMP途徑（糖酵解途徑）
有氧時，與TCA連接，將丙酮酸徹底氧化成二氧化碳和水。
無氧時，丙酮酸進一步代謝成有關(guān)產(chǎn)物。
2、HMP途徑（己糖-磷酸途徑）
產(chǎn)生大量NADPH2和多種重要中間代謝物。
3、ED途徑 2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸裂解途徑 KDPG
是少數(shù)缺乏完整EMP的微生物具有的一種替代途徑，細菌酒精發(fā)酵經(jīng)ED進行。
4、TCA循環(huán)（三羧酸循環(huán)）
真核在線粒體中，原核在細胞質(zhì)中。
TCA在代謝中占有重要樞紐地位
四種途徑產(chǎn)能比較：
二、遞氫和受氫
根據(jù)遞氫特別是最終氫受體不同劃分
1、發(fā)酵（分子內(nèi)呼吸）
無氧條件下，底物脫氫后產(chǎn)生的還原力不經(jīng)呼吸鏈而直接傳遞給某一中間代謝物的低效產(chǎn)能反應(yīng)。
在此過程中，有機物是氧化基質(zhì)，又是最終氫受體，且是未徹底氧化產(chǎn)物，結(jié)果仍積累有機物，產(chǎn)能少。
在發(fā)酵過程中，借底物水平磷酸化合成ATP，是合成ATP唯一方式。
X?P + ADP ? ATP + X
高能化合物：1 ，3- 二磷酸甘油酸、乙酰磷酸、氨甲酰磷酸、PEP、 �；o酶A。
2、有氧呼吸（呼吸作用）
底物脫氫后，經(jīng)完整的呼吸鏈（電子傳遞鏈）遞氫，以分子氧作為最終氫受體，產(chǎn)生水和放出能量。
在電子傳遞過程中，通過與氧化磷酸化反應(yīng)偶聯(lián)，產(chǎn)生ATP，稱氧化磷酸化。
1）呼吸鏈組成與順序：
2）真核與原核生物呼吸鏈比較：
位置、組成
3、無氧呼吸（厭氧呼吸）
以無機氧化物代替分子氧作為最終氫受體的生物氧化。
氧化磷酸化合成ATP，但有些能量轉(zhuǎn)移到最終受體，產(chǎn)能不多。
依據(jù)最終氫受體不同，分成多種類型。
1）硝酸鹽還原作用（反硝化作用）
由硝酸鹽逐步還原成分子氮的過程。使土壤N損失，肥力下降。屬異化性硝酸鹽還原。
2）硫酸鹽還原作用（異化性）
通常以乳酸為基質(zhì)，積累乙酸，以SO42-為最終氫受體。脫硫弧菌 Desulfovibrio sp.
3)甲烷發(fā)酵作用
產(chǎn)甲烷菌以二氧化碳為最終氫受體。如甲烷桿菌 Methanobacterium
四、不同呼吸類型微生物
與分子氧的不同關(guān)系
1、好氧微生物 aerobic
有氧條件下生長，進行有氧呼吸。
2、厭氧微生物 anaerobic
不需分子氧，進行無氧呼吸或發(fā)酵。
專性厭氧菌-只能在無氧條件下生長，分子氧對其有害。主要梭菌、產(chǎn)甲烷細菌、脫硫弧菌。
耐氣厭氧菌（aerotolerant)-無論有氧無氧，都進行發(fā)酵，分子氧無害。如乳酸菌。
3、兼性厭氧微生物 facultative anaerobic
有氧與無氧條件下均能生長，但以不同氧化方式獲得能量。
如酵母菌、一些腸道菌、反硝化細菌。
酵母菌酒精發(fā)酵時通入氧氣，發(fā)酵減慢，停止產(chǎn)生乙醇，葡萄糖消耗速率下降，氧對發(fā)酵的這種抑制現(xiàn)象稱為巴斯德效應(yīng)。
4、微好氧微生物 microaerophilic
在氧濃度較低條件下生長，進行有氧呼吸。
氧的危害
O2 + e → O2- 超氧化物自由基
有一些酶可解除危害。
五、不同發(fā)酵類型
對G發(fā)酵產(chǎn)物不同劃分，糖的無氧降解。
（一）乙醇發(fā)酵：
EMP 脫羧酶 脫氫酶
1.酵母無氧條件 ：G → 丙酮酸 → 乙醛 → 乙醇
此屬正常形式，稱Ⅰ型發(fā)酵，亦稱同型酒精發(fā)酵
2.若有亞硫酸酸氫鈉存在，與乙醛結(jié)合，而使磷酸二羥丙酮作為受氫體。
磷酸二羥丙酮 → α-磷酸甘油 → 甘油
此稱為Ⅱ型發(fā)酵，但仍有乙醇產(chǎn)生。
3．堿性條件下（PH7.6），乙醛分子間歧化反應(yīng)
一分子乙醛 → 乙酸（氧化）
一分子乙醛 → 乙醇（還原）
還有磷酸二羥丙酮 → 甘油
4．細菌同型酒精發(fā)酵，ED途徑進行，產(chǎn)生2分子乙醇。
5．細菌異型酒精發(fā)酵，通過HMP途徑進行，產(chǎn)生1分子乙醇和1分子乳酸。
總反應(yīng)式如下：
G+2ADP+2Pi → 2乙醇+2 CO2+2ATP
G+HSO3- → 甘油+乙醛oHSO3-+CO2
2G → 2甘油+乙酸+乙醇+CO2
G+ADP+Pi → 2乙醇+2 CO2+ATP
G+ADP+Pi → 乳酸+乙醇+CO2+ATP
（二）乳酸發(fā)酵
發(fā)酵產(chǎn)物中只有乳酸，經(jīng) EMP途徑，稱為同型乳酸發(fā)酵（德氏乳桿菌）。
發(fā)酵產(chǎn)物中除乳酸外，還有其他，如乙醇、CO2等稱異型乳酸發(fā)酵。經(jīng)HMP 途徑。如腸膜狀明串珠菌Leuconostoc
mesenteroides
總反應(yīng)式：
同型：G+2ADP+2Pi → 2乳酸+2ATP
異型：G+ADP+Pi → 1乳酸+乙醇+CO2+ATP
真菌：丙酮酸→ 2分子乙醇→琥珀酸→延胡索酸 →蘋果酸 → 乳酸
三）丁酸型發(fā)酵
Clostridium
所進行，特點是產(chǎn)物中都有丁酸。不同種類因酶系統(tǒng)不同，最終產(chǎn)物除丁酸外，還有其他產(chǎn)物。重要的有丁酸發(fā)酵、丙酮丁醇發(fā)酵、丁醇異丙醇發(fā)酵。
（四）丙酸發(fā)酵
由丙酸細菌Propionibacterium，與乳酸細菌相似，發(fā)酵產(chǎn)物有丙酸、乙酸、CO2。
丙酸 → 丙酸鈣（防腐劑）
（五）混合酸發(fā)酵
腸桿菌特征，產(chǎn)物有甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等有機酸，還有CO2、H2、少量2，3-丁二醇、乙酰甲基甲醇、甘油等。其中兩個重要的鑒定反應(yīng)：
1．V．P．實驗（Vagex-Proskauer）
產(chǎn)氣氣桿菌產(chǎn)2，3-丁二醇比較多，堿性條件下可氧化為二乙酰，再與肌酸或胍類衍生物縮合成紅色物質(zhì)，若加入α-萘酚、肌酸可促進反應(yīng)，此稱VP反應(yīng)。
大腸桿菌不產(chǎn)生或少產(chǎn)生2，3-丁二醇，VP反應(yīng)陰性。
2．甲基紅（M.R）反應(yīng)
大腸桿菌產(chǎn)酸多，使pH降至4.2,
甲基紅由黃變紅，反應(yīng)陽性。產(chǎn)氣氣桿菌產(chǎn)2，3-丁二醇，產(chǎn)酸少（pH5.3），甲基紅反應(yīng)陰性。
3．另外，甲酸只在堿性環(huán)境下積累（pH7.3）,而pH6.2以下，不產(chǎn)甲酸， HCOOH →
CO2+H2。甲酸脫氫酶與氫化酶聯(lián)合作用。
傷寒桿菌無甲酸脫氫酶，只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。
2節(jié)：分解代謝
一、淀粉的分解
淀粉有兩類：一類是直鏈淀粉（α-1，4-糖苷鍵）；另一類是支鏈淀粉（支鏈α-1，4、分支點α-1，6-糖苷鍵）。
1、液化型淀粉酶（α-淀粉酶）：分子內(nèi)α-1，4-糖苷鍵，不作用α-1，6-糖苷鍵以及靠近α-1，6-糖苷鍵的α-1，4-糖苷鍵。作用的結(jié)果是產(chǎn)生麥芽糖，含有6個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖，使黏度下降�？莶輻U菌通常用作α-淀粉酶的生產(chǎn)菌。
2、糖化型淀粉酶：這是一類酶的總稱。共同特點是可以將淀粉水解成麥芽糖或葡萄糖，包括以下三種：
（1）淀粉-1，4-麥芽糖苷酶（β-淀粉酶）：從非還原性末端開始，按雙糖為單位，逐步作用于α-1，4生成麥芽糖。但不作用于α-1，6，遇到α-1，6時，作用停止。作用于淀粉后的產(chǎn)物是麥芽糖與極限糊精。
（2）淀粉-1，4-葡萄糖糖苷酶（糖化酶）：
從非還原性末端開始，依次以葡萄糖為單位逐步作用于α-1，4，生成葡萄糖，但能越過α-1，6。根霉與曲霉普遍都能合成與分泌此酶。
（3）淀粉-1，6-葡萄糖苷酶（異淀粉酶）：此酶專門作用α-1，6-糖苷鍵。
二、纖維素與半纖維素的分解
纖維素是葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵連接，分子量更大，不溶于水，不能直接被人和動物消化，但它可以被許多真菌包括木霉、青霉、根霉以及放線菌與細菌中的一些菌株分解與利用
纖維素酶復(fù)合物：纖維二糖酶（β-葡萄糖苷酶），C1酶， Cx酶。
天然纖維素 C1酶 水合非結(jié)晶纖維素 Cx酶 纖維二糖+葡萄糖
纖維二糖酶
葡萄糖
細菌的纖維素酶位于細胞膜上，真菌和放線菌的纖維素酶是胞外酶。
自然界中纖維素豐富，對纖維素的研究早就成為重要的課題了。
在植物細胞壁還有半纖維素，包括各種聚戊糖與聚已糖，最常見的半纖維素是木聚糖。半纖維素容易被微生物分解，但由于半纖維素的組成類型很多，因而分解它們的酶也各不同。生產(chǎn)半纖維素酶的微生物主要有曲霉、根霉、木霉等。
三、果膠質(zhì)的分解
果膠質(zhì)是構(gòu)成高等植物細胞間質(zhì)的主要物質(zhì)，主要由D-半乳糖醛酸通過α-1，4-糖苷鍵連接。
天然果膠質(zhì)（原果膠）原果膠酶 水溶性果膠 果膠甲酯水解酶 果膠酸 果膠酸酶 半乳糖醛酸。
分解果膠的微生物主要是一些細菌和真菌，麻類植物漚浸脫膠技術(shù)就是為了利用果膠分解菌分解果膠的能力。
四、幾丁質(zhì)的分解
幾丁質(zhì)由N-乙酰葡萄糖胺通過β-1，4-糖苷鍵連接起來，含氮多糖。是真菌細胞壁和昆蟲體壁的組成成分，一般生物都不能分解與利用，只有某些細菌和放線菌能分解與利用。
幾丁質(zhì)酶使幾丁質(zhì)水解生成幾丁二糖，再通過幾丁二糖酶進一步水解生成N-乙酰葡萄糖胺。
五、油脂的分解
油脂在脂肪酶（Lipase）的作用下，逐步被水解生成甘油與脂肪酸，脂肪酸通過β-氧化進行分解。脂肪酶一般廣泛存在于真菌中。
六、烴類化合物的分解
烴類化合物是一類高度還原性的物質(zhì)，在好氧條件下，可以被一些微生物分解，主要是假單胞菌、分枝桿菌、諾卡氏菌、某些酵母等。
1、甲烷氧化：
2、正烷烴氧化：
先烴化酶（單氧酶）、鐵硫蛋白和鐵硫蛋白-NADH2還原酶作用。
三種方式：a:末端甲基氧化，
b:次末端亞甲基氧化，
c:兩端甲基氧化 ? 氧化。
3、芳香烴氧化
含苯環(huán)或聯(lián)苯類化合物，在氧化過程中逐步被氧化生成兒茶酚或原兒茶酚。兒茶酚或原兒茶酸可以在苯環(huán)的鄰位上或間位上被氧化打開，生成脂肪族化合物，再逐步分解成糖分解途徑中的中間體物質(zhì)，再按糖代謝的方式進行分解。
苯（聯(lián)苯）→兒茶酚→開環(huán)（鄰位、間位） →繼續(xù)降解。
七、蛋白質(zhì)的分解
蛋白酶（胞外） 肽酶（胞內(nèi)）
蛋白質(zhì) 肽 AA
一般真菌分解蛋白質(zhì)的能力強，并能分解天然的蛋白質(zhì)，而大多數(shù)細菌不能分解天然蛋白質(zhì)，只能分解變性蛋白以及蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物。
根據(jù)肽酶作用部位不同，分為氨肽酶（作用于有游離氨基端的肽鍵）；羧肽酶（作用于有游離羧基端的肽鍵）。
腐化 decay 和腐敗 putrefaction
八、氨基酸的分解
1、脫氨作用
有機含氮化合物在微生物作用后放出氨的生物學(xué)過程中，通常稱為氨化作用。
（1）氧化脫氨：氨基酸在有氧條件下脫氨，產(chǎn)生氨與α-酮酸，由氨基酸氧化酶催化。包括脫氨反應(yīng)（酶促）與水解反應(yīng)（非酶促）。
（2）還原脫氨作用：在無氧條件下進行，生成飽和脂肪酸和氨。
天冬氨酸 琥珀酸+NH3
（3）水解脫氨與減飽和脫氨：
氨基酸經(jīng)水解產(chǎn)生羥酸與氨：
氨基酸+水 羥酸+ NH3
通過減飽和方式進行脫氨，生成不飽和脂肪酸和氨：
天冬氨酸 延胡索酸+ NH3
（4）脫水脫氨：含羥基氨基酸（如絲氨酸）在脫水過程中脫氨。
Ser → 氨基丙烯酸 → 亞氨基丙酸 →丙酮酸 + NH3
H2O
（5） Stickland反應(yīng)
某些專性厭氧細菌如梭狀芽孢桿菌在厭氧條件下生長時，以一種氨基酸作為氫的供體，進行氧化脫氨，另一種氨基酸作氫的受體，進行還原脫氨，兩者偶聯(lián)進行氧化還原脫氨。這其中有ATP生成。這個反應(yīng)被稱為Stickland反應(yīng)。
供氫體：Ala、Leu、Val、Ser、Phe、Cys、His、Asp、Glu。
受氫體：Gly、Pro、Hyp、Orn、Arg、Trp。
丙氨酸+2甘氨酸 3乙酸+3NH3
2、脫羧作用
通過氨基酸脫羧酶作用，生成有機胺和二氧化碳。有機氨在胺氧化酶作用下放出氨生成相應(yīng)的醛，醛再氧化成有機酸，最后按脂肪酸β-氧化的方式分解。
氨基酸脫羧酶具有高度的專一性，基本上是一種氨基酸有一種脫羧酶來催化它的分解。
反應(yīng)中放出的二氧化碳可以用微量測壓計測定，因此可根據(jù)一定基質(zhì)在一定時間內(nèi)，被單位細胞作用后、產(chǎn)生二氧化碳的量來測定脫羧酶的酶活。另外，也可以分析樣品中的氨基酸的含量。
二元AA生成的二胺有毒。Lys-尸胺，Orn-腐胺
鑒定反應(yīng)
吲哚實驗與硫化氫實驗是常用的兩個鑒定實驗
1、吲哚實驗：有些細菌可以分解色氨酸生成吲哚可以與二甲基氨基苯甲醛反應(yīng)生成紅色的玫瑰吲哚，因此可根據(jù)細菌能否分解色氨酸產(chǎn)生吲哚來鑒定菌種。
2、硫化氫實驗：許多細菌能分解含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸）產(chǎn)生硫化氫，如果在蛋白胨培養(yǎng)基中加進重金屬鹽，接種細菌培養(yǎng)后觀察，若產(chǎn)生硫化氫，則出現(xiàn)黑色的硫化鉛或硫化鐵。
3節(jié)：合成代謝
一、生物合成三要素
能量 、還原力、 小分子前體物
1、能量由ATP供給，ATP產(chǎn)生有三種方式（底物水平磷酸化，氧化磷酸化，光合磷酸化）
2、還原力產(chǎn)生：還原力主要指NADH2 和NADPH2
EMP 與TCA 產(chǎn)生的NADH2有3個去向：
1）供H體（中間產(chǎn)物還原成發(fā)酵產(chǎn)物）；
2）通過呼吸鏈產(chǎn)生ATP；
3）用于細胞物質(zhì)合成。
但NADH2要先在轉(zhuǎn)氫酶作用下轉(zhuǎn)變成NADPH2才能用。
NADP+ NADH2 NADPH2+NAD
在體內(nèi)還有HMP供給NADPH2與磷酸糖 。
1G 2 NADPH2+CO2+5-P-核酮糖
NADPH2在光細菌中可通過非環(huán)式光合磷酸化方式產(chǎn)生。
3、小分子前體物：通常指糖代謝過程中產(chǎn)生的中間代謝物，有12 種。
代謝回補順序
1、合成草酰乙酸（OA）回補順序
PEP+CO2 羧化酶 OA+Pi
PY+CO2+ATP 羧化酶 OA+ADP+Pi
PEP+CO2+GDP 羧化激酶 OA+GTP
PY+CO2+NADH2 蘋果酸酶 蘋果酸+NAD
á-KD+CO2+NADH2 脫氫酶 異檸檬酸+NAD
好氧性，利用乙酸微生物，以乙醛酸循環(huán)補充草酰乙酸。
2、合成PEP的回補順序
PY+ATP PEP合酶 PEP+ADP+Pi
PY+ATP+Pi PY雙激酶 PEP+AMP+Ppi
OA+GTP PEP羧激酶 PEP+GDP+CO2
OA+PPi PEP羧轉(zhuǎn)磷酸酶 PEP+Pi+CO2
綜合總結(jié)：
二、糖類合成
（一）單糖合成
1、卡爾文環(huán)Calvin cycle（光合菌、某些自養(yǎng)菌）
（還原的磷酸戊糖環(huán)）分為三個階段：
①CO2固定②固定CO2的還原③CO2受體的再生。
關(guān)鍵酶：1，5-二磷酸核酮糖羧化酶、磷酸核酮糖激酶。
總反應(yīng)式：
6CO2+6H2O+18ATP+12NADPH2 G+18ADP+12NADP+18Pi
另外，產(chǎn)甲烷細菌有厭氧乙酰輔酶A途徑，少數(shù)光合細菌中有還原性TCA途徑等新的自養(yǎng)CO2固定途徑。
2、EMP逆過程。
3、糖異生作用。
4、糖互變作用：大量是在核苷二磷酸糖水平上進行。
（二）多糖合成
E.coli肽聚糖合成：需1個多糖引物。
1、單糖組分在細胞質(zhì)中合成(UDP是第一個載體）
2、逐步加上AA生成UDP-NAM-五肽（Park 核苷酸），順序為L-Lys, D-Glu, DAP, D-Ala,
D-Ala ( 不需tRNA參與）。其中，2D-Ala D-丙酰-D-Ala(青霉素類似）
此階段在細胞質(zhì)中進行。
3、 UDP-NAM-五肽轉(zhuǎn)至膜上，與一脂質(zhì)載體（細菌萜醇
-C55類異戊二烯醇）結(jié)合，釋放出NAM-五肽焦磷脂，在膜內(nèi)側(cè)與UDP-NAG結(jié)合，構(gòu)成肽聚糖亞單位。
細菌萜醇是第二個載體。
4、亞單位轉(zhuǎn)移至細胞壁的生長點上（插入），萬古霉素、桿菌肽抑制。
5、在細胞膜外側(cè)，亞單位與引物相連（轉(zhuǎn)糖基作用），再通過轉(zhuǎn)肽酶作用，將亞單位末端的D-丙-D-丙拆開，第四個AA與另一亞單位的DAP之間交聯(lián)，另一D-Ala釋放。
在這一步，由于青霉素是D-丙-D-丙的結(jié)構(gòu)類似物，則轉(zhuǎn)肽酶被抑制，造成肽鏈間無法交聯(lián)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也連不起來，形成 "軟壁
"，極易破裂死亡。青霉素只對正生長菌起作用，對靜息細胞無作用。
、氮類物質(zhì)合成
（一）生物固氮
分子N2通過固氮微生物作用形成NH3的過程。
1、固氮微生物 （都是原核微生物）
①自生固氮菌：好氧、厭氧、兼性厭氧及各種營養(yǎng)類型。
②共生固氮菌：與豆科共生為根瘤菌，與非豆科共生是放線菌。
③聯(lián)合固氮菌：根際、葉面微生物。
2、固氮機制
只有在不含有化合態(tài)氮的培養(yǎng)基上生長，且提供ATP、還原力等條件下才能固氮。
總反應(yīng)式： Mg2+
N2+6e+6H++12ATP 2NH3+12ADP+12Pi
固氮酶
固氮酶 組分Ⅰ：鉬鐵蛋白（MoFd）
組分Ⅱ：鐵蛋白（AzoFd)
都對氧極敏感，遇氧失活，需厭氧條件固氮。
固氮過程：
電子載體：鐵氧還蛋白（Fd），黃素氧還蛋白（Fld）也可以。
每步只傳遞2e，N2 2NH3需6e，連續(xù)三次。
固氮酶底物專一性不高，還能催化一些反應(yīng)。
C2H2→C2H4，
N2O→N2+H2O，
HCN→CH4+NH3+CH3NH2，
2H+→H2。
其中C2H2→C2H4 ，可用氣相色譜檢測，可作為固氮系統(tǒng)存在的有效指標(biāo)。
N2 2NH3去路：自生固氮菌不能儲存，也不分泌，很快同化；共生固氮菌分泌至根瘤細胞中為植物所利用。
（二）氨基酸合成
1、直接從培養(yǎng)基中吸收。
2、通過轉(zhuǎn)氨作用合成其他的氨基酸：
Glu + 丙酮酸 α-酮戊二酸 + Ala
Glu + 草酰乙酸 α-酮戊二酸 + Asp
這類反應(yīng)是由氨基移換酶催化而成。
3、微生物經(jīng)氨化作用或經(jīng)固氮作用生成的氨可以通過特定的反應(yīng)來吸收生成新的氨基酸（氨同化作用）
α-酮戊二酸+NH3 谷氨酸脫氫酶 Glu +水
NH3+ATP Glu á-KD、PY、OA
Gln合成酶 轉(zhuǎn)移酶
ADP+Pi Gln Glu、Ala、Asp
4、從前體合成氨基酸。
按前體不同可將20種氨基酸為六組：
（一）3-磷酸甘油醛：絲氨酸、半胱氨酸、甘氨酸
（二）4-磷酸赤蘚糖和磷酸烯醇式丙酮酸：色氨酸、 酪氨酸、苯丙氨酸
（三）丙酮酸：丙氨酸,亮氨酸、纈氨酸
（四）α-酮戊二酸：谷氨酸、谷酰氨 脯氨酸、精氨酸、賴氨酸（真菌中）
（五）草酰乙酸：天冬氨酸 天冬酰氨 甲硫氨酸 蘇氨酸 異亮氨酸 賴氨酸（細菌）
（六）5-磷酸核酮糖+ATP：組氨酸
初生氨基酸：Ala, Glu, Asp, Gly，氨基化所生成的氨基酸。
次生氨基酸：以初生氨基酸為前體合成。
工業(yè)生產(chǎn)氨基酸
最初利用蛋白質(zhì)水解法生產(chǎn)，1957年開始用發(fā)酵法生產(chǎn)。近年采用生化合成法：
1、酶轉(zhuǎn)化法
反丁烯二酸+NH3 Asp酶 L-Asp
丙酮酸+NH3+苯酚 Tyr酶 Tyr
2、完整細胞酶合成：選用酶活力高菌種，處理菌體使物質(zhì)易透過。
DL-Ser+丙酮酸+苯酚 菌體 L- Tyr
丙酮酸+ NH3+吲哚 菌體 L-Trp
4節(jié)：代謝調(diào)控
代謝-生化反應(yīng)-酶催化-基因編碼→基因調(diào)控
↓
環(huán)境因子影響 環(huán)境調(diào)控
代謝調(diào)節(jié)部位：真核和原核
合成調(diào)節(jié)：誘導(dǎo)合成、終產(chǎn)物阻遏、分解代謝物阻遏
酶
活性調(diào)節(jié)：反饋（終產(chǎn)物）抑制、酶活性共價修飾
一、主要調(diào)節(jié)機制
（一）酶的誘導(dǎo)合成
Karstrom 適應(yīng)酶 Monod 誘導(dǎo)酶
組成酶 Cohn 組成酶
誘導(dǎo)劑不一定是底物，但底物大多數(shù)情況下是有效誘導(dǎo)劑。
誘導(dǎo)酶只在有誘導(dǎo)劑時才合成，除去誘導(dǎo)劑就停止。是全新合成，而不是原有酶的激活。
某些酶的誘導(dǎo)物
操縱子學(xué)說
Monod & Jacob, 1962
調(diào)節(jié)基因 操縱子
P R t P O z y a t
mRNA RNA多聚酶
無誘導(dǎo)物時，結(jié)合。
阻遏物 有誘導(dǎo)物時，脫落。
（二）終產(chǎn)物阻遏（反饋阻遏）
主要在合成代謝途徑中，終產(chǎn)物或其衍生物對該途徑上一個或多個酶形成的抑制作用。
如E. coli Met, Arg的合成。
機制：調(diào)節(jié)基因 原阻遏物（阻遏物蛋白）
與終產(chǎn)物結(jié)合時被激活，與操縱基因結(jié)合，阻止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。終產(chǎn)物為輔阻遏物。屬于正調(diào)節(jié)。
（三）分解代謝物阻遏（葡萄糖效應(yīng)）
Monod研究E. coli 對混合碳源利用，發(fā)現(xiàn)葡萄糖抑制其它糖利用，出現(xiàn)二次生長。
所有迅速代謝能源都能阻抑較慢代謝的能源所需酶的合成。酶的生成被易分解碳源所阻遏。此稱葡萄糖效應(yīng)。
酶大多數(shù)是誘導(dǎo)酶。
葡萄糖效應(yīng)并不是由葡萄糖直接造成，而是葡萄糖某種分解代謝物引起。
cAMP（環(huán)腺苷酸）是關(guān)鍵控制因子。
其與分解代謝物活化蛋白（CAP）結(jié)合，促使RNA多聚酶與啟動基因結(jié)合而開始轉(zhuǎn)錄。 cAMP濃度低時，影響結(jié)合，不能轉(zhuǎn)錄。
葡萄糖的某種代謝產(chǎn)物降低了cAMP水平，即使有誘導(dǎo)劑存在，也不能合成分解其它糖的酶，只有葡萄糖消耗完，
cAMP水平上升，才能開始轉(zhuǎn)錄、合成。
ATP 腺苷酸環(huán)化酶 cAMP 磷酸二酯酶 AMP
（四）反饋抑制
1、協(xié)同反饋抑制：終產(chǎn)物不能單獨抑制，要幾個終產(chǎn)物同時作用，合作抑制。如多粘芽孢桿菌的Asp族氨基酸合成。6-53
2、合作反饋抑制：兩種終產(chǎn)物同時存在，起著比一種大得多的抑制。 圖6-54
3、同工酶：多個酶催化同一個反應(yīng)，分別受不同終產(chǎn)物抑制。圖6-51
如大腸桿菌的Asp族氨基酸合成，圖6-52
4、順序反饋抑制：代謝途徑中第一個酶不受終產(chǎn)物抑制，而受分支處中間產(chǎn)物抑制，終產(chǎn)物抑制引起中間產(chǎn)物積累，從而抑制第一個酶。圖6-57
如紅色假單胞菌的Ile合成。
5、積累反饋抑制：每一個終產(chǎn)物單獨、部分地抑制共同步驟的第一個酶，互不影響。圖6-55
如大腸桿菌的Gln合成酶受8個終產(chǎn)物抑制。圖6-56
調(diào)節(jié)位點（變構(gòu)中心）
反饋抑制機制：變構(gòu)酶
底物位點（活性中心）
（五）酶活性共價修飾
由一個修飾酶（活化酶）催化另一種酶起共價修飾的改變，從而改變后者活性。
酶-X 酶 + X （X：小分子化合物）
修飾酶
如大腸桿菌Gln合成酶：AMP與酶共價結(jié)合時（腺苷酰轉(zhuǎn)移酶催化）活性低，脫去AMP，活性高。
膠質(zhì)假單胞菌檸檬酸裂解酶：乙酰化（有活性），脫乙�；o活性）
二、代謝調(diào)控應(yīng)用
(一）在初級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)上應(yīng)用
反饋調(diào)節(jié)最重要，要繞過，方法如下：
1、降低末端產(chǎn)物濃度（應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型解除正常反饋調(diào)節(jié)）
單線途徑：應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型積累中間代謝物，采用低濃度終產(chǎn)物供給。
Ea Eb Ec
A B C D E
Ec 缺失，積累C，低濃度供給E。
分支途徑：積累末端產(chǎn)物。
E1 F G
A B C D E
E2 H I
E1缺失，限制I，少量E→G，大部分分泌。
Lys生產(chǎn)：高Ser缺陷型，圖6-62
肌苷酸生產(chǎn)：腺嘌呤缺陷型，圖6-63
2、篩選抗反饋突變株（解除反饋）
在含有抗代謝物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選抗性突變株，其中一些可分泌大量末端產(chǎn)物。如對氨基Phe/Tyr, 7-氮雜Trp/Trp
3、控制細胞膜滲透性
通過生理學(xué)或遺傳學(xué)方法，改變膜透性，使胞內(nèi)代謝物迅速滲漏到胞外，解除反饋抑制。
（二）在次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)上應(yīng)用
次級代謝產(chǎn)物通常在細胞生長后期形成，主要是抗生素、毒素、甾體化合物等。在自然條件下，微生物產(chǎn)生次級產(chǎn)物能力一般不高，其生產(chǎn)也受代謝調(diào)控。
可通過誘變育種和控制環(huán)境條件來提高產(chǎn)量，但次級產(chǎn)物合成途徑比較復(fù)雜，許多還不清楚，因此關(guān)于次級產(chǎn)物合成的確實控制部位還大多不明。
青霉素生產(chǎn)中，葡萄糖雖能很好利用，但生產(chǎn)不適宜，而乳糖雖緩慢利用，卻可多產(chǎn)青霉素。在含葡萄糖和乳糖混合培養(yǎng)基中，生長階段迅速利用葡萄糖，葡萄糖用盡時，對乳糖利用解阻遏，不生長，但產(chǎn)青霉素。也可利用后期流加限量葡萄糖的方法實現(xiàn)。
其他次級產(chǎn)物生產(chǎn)也廣泛采用這種方法。另外，氮源種類、濃度對次級產(chǎn)物產(chǎn)生與積累也有很大的影響，磷酸鹽也有影響。 （三）在酶生產(chǎn)上應(yīng)用
酶合成受基因和代謝物雙重控制
1、加誘導(dǎo)劑
誘導(dǎo)酶只有在誘導(dǎo)劑存在時形成，在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑。要注意底物誘導(dǎo)劑的濃度。
2、降低阻遏物濃度
參與分解代謝的酶，通常受誘導(dǎo)和阻遏雙重控制，包括終產(chǎn)物阻遏和分解代謝物阻遏。為了大量生產(chǎn)酶，要避免使用豐富，復(fù)雜培養(yǎng)基，不要含快速利用的糖類。合成酶類通常被終產(chǎn)物阻遏，要對產(chǎn)生阻遏的化合物加以限制。
3、利用突變產(chǎn)生不需誘導(dǎo)物或不受阻遏的突變體
（1）生長在低濃度誘導(dǎo)物中選育不需誘導(dǎo)劑的組成性突變株。
（2）利用抗代謝物，篩選不受終產(chǎn)物阻遏的突變體。
（3）利用被阻遏的酶的底物作唯一的碳源，可篩選不受分解代謝物阻遏的突變體。
4、增加基因模板
將外源特異基因?qū)胛⑸矬w內(nèi)，增加酶產(chǎn)量。
（1）游離基因轉(zhuǎn)移法
（2）phage轉(zhuǎn)導(dǎo)法
5節(jié)：自養(yǎng)菌代謝（微生物的自養(yǎng)代謝）
一、光能自養(yǎng)菌
藍細菌與高等植物相同，含葉綠素a, b, 其余含菌綠素，有光合膜。光合作用只在有光合色素存在時才進行。
葉綠素（主要色素）：捕獲能量與光反應(yīng)中心
光合色素
類胡蘿卜素（輔助色素）：只捕能并傳至葉綠素
（一）主要類群
P150表解
屬于原核微生物，歸于紅螺菌目，利用硫化氫、氫氣或有機物作為供氫體。常存在于水較清，可透光的厭氧環(huán)境中。
1、紅螺菌科（紫色無硫細菌）：有機物為供氫體，兼性光合。光能異養(yǎng)。
2、著色菌科（紫色硫細菌）：專性厭氧，專性光合，硫化物為供氫體，體內(nèi)外積累硫。光能自養(yǎng)。
3、綠菌亞目：綠菌科-綠硫細菌，綠彎菌科-綠色非硫細菌。專性厭氧，專性光合，硫化物為供氫體，胞外積累硫。
（二）光合作用
光反應(yīng)：光合色素吸收光能并轉(zhuǎn)化為化
學(xué)能的能量轉(zhuǎn)換反應(yīng)。
暗反應(yīng)：利用能量進行CO2同化。
光合磷酸化即光能引起葉綠素分子逐出電子，并通過電子傳遞產(chǎn)生ATP的方式。
1、環(huán)式光合磷酸化
逐出電子經(jīng)電子傳遞又回到菌綠素，使其恢復(fù)到原狀態(tài)，其間產(chǎn)生ATP，但不產(chǎn)生還原力，不放出氧氣。光合細菌屬此類。P151，圖6-33
光合菌還原力來自硫化氫，方式可能是逆向電子傳遞，消耗光反應(yīng)產(chǎn)生的ATP。
H2S + NAD S + NADH2 積累硫
NADH2+NADP NAD+NADPH2
2、非環(huán)式光合磷酸化
兩個光反應(yīng)系統(tǒng)，除產(chǎn)生ATP，還有還原力，放出氧氣。植物、藍細菌屬此類。
還原力來自水的光解。P151,圖6-34
3、噬鹽菌紫膜的光合作用
無葉綠素或菌綠素參與的獨特的光合作用，是迄今為止最簡單的光合磷酸化反應(yīng)。（自學(xué)）
二、化能自養(yǎng)菌
無機物氧化獲能,通過卡爾文環(huán)同化CO2
產(chǎn)能主要方式是氧化磷酸化，還原力產(chǎn)生是逆向電子傳遞。P148,圖6-30
無機物氧化時，以不同位置進入呼吸鏈，這與異養(yǎng)菌不同，產(chǎn)能效率低。圖6-31
1、硝化細菌
將氨氧化成亞硝酸-亞硝酸細菌
亞硝酸氧化成硝酸-硝酸細菌
NH4++1?O2→NO2-+2H++H2O+66千卡
NO2-+?O2 →NO3-+18千卡 圖6-32
2、硫細菌
引起元素硫或還原態(tài)硫化物氧化，包括光能與化能�；芗戳蚧毦�。最多是硫桿菌Thiobacillus。
S2-→S→SO32-→SO42-
由于產(chǎn)硫酸，會引起金屬腐蝕，也可用于濕法冶金。
2S+3O2+2H2O →2H2SO4（T. thiooxidans)
4FeSO4+O2+2H2SO4 →2Fe2(SO4)3+2H2O(T. ferrooxidans)
硫酸及硫酸高鐵是有效浸溶劑。
CU2S+ 2Fe2(SO4)3 →2CUSO4 + 4FeSO4 +S
FeS2 +7Fe2(SO4)3 +8H2O →15FeSO4 + 8H2SO4
3、氫細菌
兼性自養(yǎng)菌。H2 +?O2 →H2O+56.5千卡
4、鐵細菌
將亞鐵氧化成高鐵，尚未純培養(yǎng)。
自養(yǎng)菌總結(jié)
光合細菌類群 主要供氫體、 碳源、 生長因子、 O2釋放
綠硫細菌 S2-、S2O32-，H2 CO2 - -
著色細菌 S2-、S2O32-，H2 CO2 - -
紅螺細菌 有機物 有機物 + -
藍細菌 水 CO2 - +
化能自養(yǎng)型菌生理類群
類群 氧化基質(zhì)及電子供體 氧化產(chǎn)物
亞硝酸細菌 NH4+ NO2- H2O
硝酸細菌 NO2- NO3- H2O
硫化細菌 H2S、S、S2O32-、Fe2+ SO42- H2O Fe3+
氫細菌 H2 H2O
鐵細菌 Fe2+ Fe3+
最終電子受體均為O2
第四章：微生物生長
生長：有機體的細胞組分與結(jié)構(gòu)在量方面的增加。
繁殖：單細胞-由于細胞分裂引起個體數(shù)目的增加。
多細胞-通過無性或有性孢子使個體數(shù)目增加的過程。
發(fā)育：適合條件下，生長與繁殖始終是交替進行的，從生長到繁殖是一個由量變到質(zhì)變的過程，這個過程稱為發(fā)育。
1節(jié)：微生物的發(fā)育周期
一、概念
發(fā)育周期、單細胞微生物、絲狀真菌
二、發(fā)育周期中細胞學(xué)上變化
1、細胞壁與質(zhì)膜的延伸
質(zhì)膜合成位點在赤道帶，細胞壁生長也定位在赤道區(qū)，并具有種的特異性。
2、DNA的復(fù)制
1）單向復(fù)制 John Cairns：E. Coli作材料，放射自顯影技術(shù)。染色體從起始點開始，反時針旋轉(zhuǎn)一周完成。
2）雙向復(fù)制 Hiroshi Yoshikawa：不只按一個方向復(fù)制，起點與終點不重合。
3）滾環(huán)模型：不對稱復(fù)制。一股線狀，一股環(huán)狀復(fù)制。
真核微生物復(fù)制有多個位點，都是雙向。
3、發(fā)育循環(huán)中基因的表達
DNA的復(fù)制與細胞分裂是協(xié)調(diào)的。細胞分裂總是發(fā)生在DNA復(fù)制后的一定時間內(nèi)。抑制DNA合成的各種化學(xué)處理或突變也抑制細胞分裂。細菌DNA復(fù)制需DNA起始蛋白作用。
E. coli 細胞分裂總是發(fā)生在DNA復(fù)制完成后大約20分鐘，而DNA復(fù)制需40分鐘，這樣世代時間應(yīng)是60分鐘，但…...
三、細胞分化現(xiàn)象
在某些微生物的發(fā)育循環(huán)中，一個或一群細胞會從一種形態(tài)與功能轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N形態(tài)與功能，此稱細胞分化或形態(tài)發(fā)生。
2節(jié)：微生物純培養(yǎng)的生長
一、純培養(yǎng)的分離方法 表
二、生長測定（適用、注意事項）
直接計數(shù)法（全數(shù)）
間接計數(shù)法（活菌數(shù)）
測細胞物質(zhì)量
三、細菌純培養(yǎng)群體生長規(guī)律
將少量純培養(yǎng)接種到一恒定體積的新鮮液體培養(yǎng)基中，適宜條件下培養(yǎng)，定時取樣測定細菌含量，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以細菌數(shù)目的對數(shù)或生長速率為縱坐標(biāo)，得繁殖曲線，對單細胞而言，又稱生長曲線。
根據(jù)生長速率不同，分為幾個時期。
（一）延遲期 lag phase(停滯期、調(diào)整期）
表現(xiàn)：不立即繁殖，生長速率近于0，菌數(shù)幾乎不變，細胞形態(tài)變大。
特點：分裂遲緩，合成代謝活躍，體積增長快，對外界不良環(huán)境敏感。
原因：調(diào)整代謝，合成新的酶系和中間代謝產(chǎn)物以適應(yīng)新環(huán)境。
消除：增加接種量；采用最適菌齡接種；培養(yǎng)基成分（種子、發(fā)酵）
（二）對數(shù)期 log phase
表現(xiàn)：代謝活性最強，幾何級數(shù)增加，代時最短，生長速率最大。
特點：細菌數(shù)目增加與原生質(zhì)總量增加，與菌液濁度增加呈正相關(guān)性。
代時（generation time）：單個細胞完成一次分裂所需時間，亦即增加一代所需時間。
G=t1-t0/n y=xo2n n=lgy - lgx/lg2
導(dǎo)出 G = t1 - t0 /3.3(lgy - lgx)
影響G因素：菌種、營養(yǎng)成分、營養(yǎng)物濃度（很低時影響）、培養(yǎng)溫度。
（三）穩(wěn)定期 stationary phase(最高生長期、靜止期）
表現(xiàn)：新增殖細胞數(shù)與老細胞的死亡數(shù)幾乎相等，活菌數(shù)動態(tài)平衡。
特點：生長速率又趨于0，細胞總數(shù)最高。
原因：養(yǎng)分減少；有毒代謝物產(chǎn)生。
穩(wěn)定期細胞內(nèi)開始積累貯存物，此階段收獲菌體，也是發(fā)酵過程積累代謝產(chǎn)物的重要階段。
延長：補料，調(diào)pH、溫度等。
此時，菌體總數(shù)量與所消耗的營養(yǎng)物之間存在一定關(guān)系，稱為產(chǎn)量常數(shù)（生長效率）。Y = X - X0 /C
其中X-穩(wěn)定期細胞干重/ml， X0 -接種時干重/ml，C-限制性營養(yǎng)物濃度。
根據(jù)這一原理，可進行生物測定。
將未知混合物加到只缺乏特定限制性營養(yǎng)物的完全培養(yǎng)基中，測定培養(yǎng)基所能達到的生長量，就可以計算出原混合物中特定限制性營養(yǎng)物的濃度。
（四）衰亡期 decline phase
表現(xiàn)：出現(xiàn) "負生長 "，有些細胞開始自溶。
對于絲狀真菌，細胞數(shù)目不呈幾何級數(shù)增加，無對數(shù)生長期，一般有調(diào)整期，最高生長期，衰退期。
四、連續(xù)培養(yǎng) continuous cultivation
分批培養(yǎng) batch culture ：將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)生長，最后一次收獲。
若不斷補充新鮮營養(yǎng)，并及時不斷以同樣速度排出培養(yǎng)物，則可延長對數(shù)期。
只要培養(yǎng)液的流動量能使增殖的新菌數(shù)相當(dāng)于流出的老菌數(shù)，就可保證總菌量不變，此即連續(xù)培養(yǎng)原理。
主要參數(shù)：D（稀釋率）=F（流動速率）/V（容積）
連續(xù)培養(yǎng)方法
1、恒濁連續(xù)培養(yǎng) turbidostat
不斷調(diào)節(jié)流速使培養(yǎng)液濁度保持恒定。
裝置
適用：收獲菌體及與菌體相平行的產(chǎn)物。
2、恒化連續(xù)培養(yǎng) chemostat
恒定流速，及時補充營養(yǎng)，營養(yǎng)物濃度基本恒定，從而保持恒定生長速率。又稱恒組成連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分中，必須將某種必需的營養(yǎng)物控制在較低的濃度，以作為限制性因子，而其它營養(yǎng)物過量。常用的有氨、氨基酸、葡萄糖、生長因子、無機鹽等。
適用；科研
兩種方法比較：
五、同步生長 synchronous growth
概念：使所有的細胞都能處于同一生長階段，同時分裂的生長方式。
同步培養(yǎng)法獲得：
（一）機械法（選擇法）
1、離心沉降分離法
2、過濾分離法
3、硝酸纖維素薄膜法
（二）調(diào)整生理條件法（誘導(dǎo)法）
1、溫度調(diào)整法：亞適生長溫度-->最適生長溫度培養(yǎng)。
2、營養(yǎng)條件調(diào)整法：控制濃度或組成，使細胞只能進行一次分裂。
3、用穩(wěn)定期的培養(yǎng)物接種：穩(wěn)定期細胞處于衰老狀態(tài)，移入新鮮培養(yǎng)基，可得同步生長。
（三）抑制DNA合成法
DNA合成是細胞分裂前提。抑制一段時間再解除抑制。
3節(jié)：環(huán)境條件對生長影響
一、溫度
影響兩方面。
最低、最適、最高生長溫度，致死溫度。
微生物生長溫度類型：
低溫型（嗜冷微生物）
中溫型（嗜溫微生物）
高溫型（嗜熱微生物）
二、pH
主要影響：引起膜電荷變化，從而影響營養(yǎng)吸收；影響酶活性；改變營養(yǎng)物狀態(tài)和有害物毒性。
有最適pH，此時酶活性最高，其他條件適合，生長速率最高，但不是生產(chǎn)的最適pH。
微生物細胞內(nèi)的pH多接近于中性。
pH調(diào)節(jié)措施：
三、氧化還原電位 Eh
Eh與氧分壓有關(guān)，也與pH有關(guān)。
不同種類微生物所要求的Eh不同。
Eh影響酶活性，也影響呼吸作用。
四、輻射
指通過空氣或外層空間以波動方式從一個地方傳播或傳遞到另一個地方的能量。
（一）紫外線（非電離輻射）10-380nm
致死主要是細胞中很多物質(zhì)對紫外線吸收。殺菌作用隨劑量增加而增加。紫外線穿透力弱，應(yīng)用于空氣消毒、表面消毒、菌種誘變。
（二）電離輻射（X、α、β、γ）
效應(yīng)無專一性， α、β穿透力較弱，X、 γ較強。
KI對電離輻射具保護作用。
五、干燥
水分對正常生長必不可少，各種微生物抵抗干燥能力不同。
六、滲透壓
微生物對滲透壓有一定適應(yīng)能力。高滲溶液-質(zhì)壁分離，低滲溶液-細胞膨脹破裂。
七、超聲波（20，000Hz以上）
使細胞破裂，科研中破碎細胞。
八、表面張力
4.5--6.5x10-4 N/cm，降低影響。
4節(jié)：滅菌與消毒
滅菌 sterilization ：殺死所有微生物。
消毒 disinfection ：殺死一切病原微生物。
防腐 antisepsis：利用理化因素抑制微生物生長繁殖。
化療 chemotherapy：利用具有選擇毒性化學(xué)藥物或抗生素來抑制宿主體內(nèi)病原微生物的生長繁殖，借以達到治療的一種措施。
一、常用滅菌消毒方法
1、干熱滅菌法
火焰滅菌（灼燒滅菌）、干熱滅菌
2、濕熱滅菌
巴氏消毒、煮沸消毒、高壓蒸汽滅菌、間歇加熱滅菌、實罐滅菌
3、過濾除菌
4、放射線滅菌
二、常用的消毒劑
理想的消毒劑：殺菌力強，使用方便；價廉；對人、畜無害；能長期保存；溶解度大；無腐蝕性等。
消毒劑種類：氧化劑、重金屬鹽、有機化合物
相對藥效：
三、影響滅菌與消毒因素
1、微生物種類
2、培養(yǎng)基
3、消毒劑
4、環(huán)境因素
5節(jié)：化學(xué)療劑對微生物作用
能直接干擾病原微生物的生長繁殖并可用于治療感染性疾病的化學(xué)藥物。
化學(xué)療劑能選擇性地作用于病原微生物新陳代謝的某個環(huán)節(jié)，使其生長受到抑制或致死。
一、抗代謝物
結(jié)構(gòu)上類似，競爭性地與酶結(jié)合，只有當(dāng)正常代謝物量少或不存在時才起作用。
最常用的是磺胺類藥物。是氨苯磺胺衍生物，其結(jié)構(gòu)與對氨基苯甲酸（PABA）類似，而PABA是葉酸分子組成。葉酸是輔酶，在氨基酸、維生素合成中起重要作用，許多細菌需自己合成葉酸，而人和動物利用現(xiàn)成葉酸，因此不受磺胺干擾。
還有異煙肼rimifon，是吡哆醇對抗物。
二、抗生素
作用范圍：抗菌譜
作用位點：
1、抑制細胞壁合成：青霉素，多氧霉素
2、影響細胞膜功能：多肽類，多烯類
3、干擾蛋白合成：抑制而非殺死
4、阻礙核酸合成：對細胞有毒
三、微生物抗藥性
對藥物的適應(yīng)性即是抗藥性。
抗藥性主要表現(xiàn)（產(chǎn)生機制）
1、菌體內(nèi)產(chǎn)生鈍化或分解藥物的酶
2、改變膜的透性而導(dǎo)致抗藥性產(chǎn)生
3、被藥物作用的部位發(fā)生改變
4、形成救護途徑。
五章：微生物遺傳
遺傳heredity-親代將其特有的生物學(xué)特性傳遞給子代。
遺傳性-子代總保持與親代相同的生物學(xué)特性。
遺傳型genotype-生物體所具有的全套遺傳物質(zhì)總稱。又稱基因型。
表型phenotype-特定環(huán)境中生物體表現(xiàn)出的種種形態(tài)與生理特征。
變異variation- 遺傳型的改變。
適應(yīng)或飾變modification-表型的改變。
基因-指帶有足以決定一個蛋白質(zhì)全部組成所需信息的最短DNA片段。
菌株&克隆-指一組遺傳型相同的細胞群。
微生物在遺傳上特點：
1、微生物細胞結(jié)構(gòu)簡單，營養(yǎng)體一般為單倍體，方便建立純系。
2、很多常見微生物都易于人工培養(yǎng)，快速、大量生長繁殖。
3、對環(huán)境因素的作用敏感，易于獲得各類突變株，操作性強。大多是無性生殖，變異易保留。
1節(jié)：遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)
一、證明經(jīng)典實驗
（一）轉(zhuǎn)化實驗
1928，Griffith首次發(fā)現(xiàn)Streptococcus pneumoniae的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。
1944，Avery等在離體條件下重復(fù)這一實驗，并對轉(zhuǎn)化本質(zhì)進行了研究。
終于證明了DNA是遺傳物質(zhì)。
Griffith轉(zhuǎn)化實驗：
Avery轉(zhuǎn)化實驗
（二）噬菌體T2的感染實驗
1952，Hershey & Chase 用E. coli, phage T2做材料，利用同位素示蹤法進行實驗。
蛋白質(zhì)只含S不含P，DNA只含P不含S，分別用35S、32P標(biāo)記E. coli, 用T2感染，得到35ST2、32PT2。
實驗過程（插入）
（三）病毒拆開與重建實驗
1956，F(xiàn)raenkel & Conrat
用TMV（煙草花葉病毒）和HRV（霍氏車前病毒）進行實驗，說明遺傳信息在RNA中。
（插入）
二、遺傳物質(zhì)在細胞中存在方式
（一）細胞水平
（二）核水平（plasmid）
（三）染色體水平
（四）核酸水平
（五）基因水平（遺傳功能單位）
（六）密碼子水平（遺傳信息單位）
（七）核苷酸水平（最低突變或交換單位）
染色體外遺傳物質(zhì)-質(zhì)粒
染色體外，獨立存在的，能自主復(fù)制的遺傳物質(zhì)。
雙股環(huán)狀DNA，可游離存在，也可整合到宿主DNA上。
吖啶類染料、高溫、某些離子作用可消除質(zhì)粒。
附加體episome：質(zhì)粒插入到染色體上和染色體一起復(fù)制。
質(zhì)粒種類
1、F因子（致育因子）：大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，含質(zhì)粒為F+（♂）；無質(zhì)粒為F-（♀）；質(zhì)粒DNA整合到染色體上為Hfr.
2、R因子（耐藥性）：痢疾桿菌，多價耐藥性，耐藥信息攜帶在質(zhì)粒上。
3、Col因子（大腸桿菌素產(chǎn)生因子）
4、青霉素酶質(zhì)粒
5、Ti質(zhì)粒（誘癌質(zhì)粒）：植物根癌，植物基因工程重要載體。
6、降解質(zhì)粒：Pseudomonas
隱蔽質(zhì)粒、表達質(zhì)粒、分泌質(zhì)粒等。 ←
2節(jié)：基因突變
突變mutation-遺傳物質(zhì)核酸中的核苷酸順序突然發(fā)生了可遺傳的變化。
包括基因突變（點突變）-由于DNA鏈上的一對或少數(shù)幾對堿基發(fā)生改變而引起。
染色體畸變-DNA的大段變化現(xiàn)象，表現(xiàn)為插入、缺失、重復(fù)、易位、倒位。
由于重組或附加體等外源遺傳物質(zhì)的整合而引起的DNA改變，不屬突變范圍。
一、基因突變
（一）類型
按突變體mutant表型 特征不同
1、形態(tài)突變型：細胞或菌落形態(tài)改變。
2、生化突變型：代謝途徑變異
營養(yǎng)缺陷型-由基因突變引起某酶合成能力喪失，必須在原有培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能生長。
抗性突變型-能抵抗有害理化因素，包括抗藥性、抗噬菌體等。
抗原突變型-細胞成分尤其是表面成分的細致變異。
3、致死突變型：基因突變導(dǎo)致個體死亡。
4、條件致死突變型：在某一條件下呈現(xiàn)致死效應(yīng)，如溫度敏感突變型。
如果從研究者能否從巨大群體中迅速檢測和分離出個別突變體的目的來看，則只有兩類突變：
選擇性突變-具有選擇性標(biāo)記，可通過某種環(huán)境條件使它們得到優(yōu)勢生長，從而取代原始菌株。
非選擇性突變-無選擇性標(biāo)記，而只有一些性狀的數(shù)量差別，如菌落大小、顏色深淺、代謝物產(chǎn)量等。
（二）特點
1、不對應(yīng)性：
突變的性狀與引起突變的原因間無直接的對應(yīng)關(guān)系。
相應(yīng)的環(huán)境僅起著淘汰原有非突變型個體的作用，如果說其有誘變作用，也可以誘發(fā)任何性狀的變異，而不是專一性地誘發(fā)一種變異。
2、自發(fā)性：
各種突變可以在沒有人為的誘變因素下自發(fā)發(fā)生。
3、稀有性：
自發(fā)突變頻率較低，一般10-6?10-9 。
突變率- 每個細胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率�；蛎繂挝蝗后w在繁殖一代過程中形成的突變體的數(shù)目。
一個細胞長大分裂成兩個細胞的過程稱為細胞世代。
細胞世代數(shù)=n-n0, 對于非同步生長來說，對數(shù)生長期，平均世代數(shù)= n-n0 /Ln2, m 為n-n0 期突變體數(shù)目，
突變率= m
n-n0 /Ln2
測定m的簡單辦法是將一細胞群體培養(yǎng)在平板上，讓突變在平板培養(yǎng)中發(fā)生。這種情況下，每一突變產(chǎn)生一固定在原位的突變體克隆，經(jīng)適當(dāng)處理可以以單一菌落狀態(tài)檢出。
非選擇性突變的突變率很難測定。
4、獨立性：
突變的發(fā)生一般是獨立的，某一基因的突變，既不提高也不降低其他基因的突變率。突變不僅對某一細胞是隨機的，而且對某一基因也是隨機的。
5、誘變性：
誘變劑作用可提高突變率。
6、穩(wěn)定性：
遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生的穩(wěn)定變化，因而產(chǎn)生的新性狀也是穩(wěn)定的，可遺傳的。
7、可逆性
野生型?突變型，為正向突變
野生型?突變型，為回復(fù)突變（回變）。
（三）自發(fā)性與不對應(yīng)性的證明
突變是通過適應(yīng)而產(chǎn)生的，突變的原因與性狀間是相對應(yīng)的。
突變是自發(fā)的，與環(huán)境是不相對應(yīng)的。
1、變量試驗（1943，Luria & Delbruck）
實驗要點：（插入）
結(jié)果：甲各皿抗性菌落數(shù)相差較大，乙各皿數(shù)基本相同。
說明：抗性突變不是由噬菌體誘導(dǎo)出來的。
如果是噬菌體誘導(dǎo)的話，結(jié)果會怎樣？
突變發(fā)生在什么時間？
噬菌體起什么作用？
2、涂布試驗（1949，Newcombe設(shè)計）
實驗要點（插入）
說明：抗性突變發(fā)生在未接觸噬菌體之前，噬菌體加入只起篩選作用。
如果不是這樣，結(jié)果會怎樣？
3、影印培養(yǎng)試驗（1952，Lederberg設(shè)計）
影印培養(yǎng)法-使在一系列培養(yǎng)皿相同位置上能出現(xiàn)相同菌落的一種接種培養(yǎng)方法。
利用此法可以從在非選擇性條件下生長的群體中，分離出各類突變體。
實驗要點：（插入）
結(jié)果：3上出現(xiàn)抗性菌落，在2上找出相應(yīng)菌落接種到含藥平板上，長出抗性菌落。而取與3上無對應(yīng)關(guān)系的菌落接種到含藥平板上則無生長。
（四）突變機制
1、誘變機制 induce mutation , mutagen
1）堿基對置換（點突變）
只涉及一對堿基被另一對堿基所置換，分為轉(zhuǎn)換和顛換。
①直接引起置換的誘變劑
可直接與堿基發(fā)生反應(yīng)，不論在體內(nèi)還是離體都起作用。包括亞硝酸、羥胺和各種烷化劑（硫酸二乙酯、NTG等）。
以HNO2為例：
HNO2 可使堿基氧化脫氨，使A→H，C→U，G→X。
AT→HeT HkC HkC
②間接引起置換的誘變劑
一些堿基結(jié)構(gòu)類似物，但穩(wěn)定性比正常堿基小，易發(fā)生互變。通過活細胞的代謝活動摻入到DNA中，只對正在生長發(fā)育的細胞有作用，即DNA復(fù)制時起作用。
主要是5-BU，5-AU，2-AP，8-NG等。
以5-BU為例：
AT A:5-BU(酮式） AT GC
AT G:5-BU(烯醇式） A:5-BU(酮式）
還可以看出5-BU摻入引起GC回復(fù)至AT的過程。
堿基對置換對密碼子影響
簡拼 UCG(Ser)（不表現(xiàn)突變現(xiàn)象）
錯義 UAC(Tyr)
UCC 錯義 UUC(Phe) (所合成蛋白質(zhì)
(Ser) 有活性或純化)
無義 UAA(終止符)（合成一些蛋白質(zhì)碎片）
2）移碼突變
由一種誘變劑引起DNA分子中一個或少數(shù)幾個核苷酸的增添或缺失，從而使該部位后面的全部密碼的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯發(fā)生錯誤。也屬于DNA分子的微小損傷。
主要是吖啶類染料，一系列ICR化合物。
在DNA鏈上增缺1、2、4、5堿基，可引起移碼突變，增缺3、6，則不影響讀碼，只引起短的缺、增。
3）染色體畸變
DNA分子大的損傷。
①數(shù)量變化：真核有倍數(shù)性變化和非倍數(shù)性變化；原核只一條染色體，獲得一段DNA，形成部分二倍體。
②結(jié)構(gòu)變化：又分染色體內(nèi)與染色體間畸變（非同源染色體間易位）。
4）轉(zhuǎn)座因子 transposible element
1940`s B. McClintock 玉米遺傳研究發(fā)現(xiàn)染色體易位。
在染色體組中或染色體組間能改變自身位置的一段DNA序列稱作轉(zhuǎn)座因子。
有三類：
插入序列 IS：0.7-1.4 kb，只能引起轉(zhuǎn)座效應(yīng)，不含其它基因。
轉(zhuǎn)座子 Tn ：2-2.5 kb，含有幾個至十幾個基因。
Mu噬菌體：37 kb，含有20多個基因。
2、自發(fā)突變機制
Spontanous mutation：指微生物在沒有人工參與下發(fā)生的突變。
1）背景輻射和環(huán)境因素的誘變：低劑量長期效應(yīng)。輻射、高溫、低濃度誘變劑。
2）自身代謝產(chǎn)物的誘變：H2O2-內(nèi)源誘變劑。
3）互變異構(gòu)效應(yīng)：T、G酮式或烯醇式，A、C氨基式或亞氨基式。一般傾向于酮式和烯醇式。T以烯醇式與G配對，C以亞氨基式與A配對。
4）環(huán)出效應(yīng)：DNA復(fù)制過程中偶爾環(huán)出。
（五）紫外線對DNA的損傷及機體對損傷DNA的修復(fù)
紫外線作用：同鏈DNA的相鄰T間形成共價T二聚體，阻礙堿基間正常配對，從而引起突變或死亡。
機體對損傷DNA的修復(fù)：
1、光復(fù)活作用：經(jīng)UV照射后的微生物暴露于可見光下，可明顯降低起死亡率，此稱光復(fù)活作用。
2、暗修復(fù)作用（切補修復(fù)）：與光無關(guān)，須4種酶參與：核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶。
3、重組修復(fù)：發(fā)生在DNA復(fù)制過程或復(fù)制之后，不切除DNA損傷部位的修復(fù)。DNA鏈在復(fù)制時，受損的模板作用消失，互補單鏈（新鏈）里留下空隙，產(chǎn)生誘導(dǎo)信號，recA基因被誘導(dǎo)，產(chǎn)生大量重組蛋白，與新鏈缺口結(jié)合，引起
子鏈和母鏈交換。交換后母鏈缺口，通過聚合作用，以對側(cè)子鏈為模板合成DNA 片段填充，連接酶連接新舊鏈完成復(fù)制。
4、SOS修復(fù) ：一種能夠引起誤差修復(fù)的緊急呼救修復(fù)，是在無模板DNA
情況下合成酶的誘導(dǎo)修復(fù)。正常情況下無活性有關(guān)酶系，DNA受損傷而復(fù)制又受到抑制情況下發(fā)出信號，激活有關(guān)酶系，對DNA損傷進行修復(fù)，其中DNA多聚酶起重要作用，在無模板情況下，進行DNA修復(fù)再合成，并將DNA片段插入受損DNA空隙處。
5、DNA 多聚酶的校正作用：DNA
多聚酶除了對多核苷酸的多聚作用外，還具有3`到5`核酸外切酶作用，依靠這一作用，能在復(fù)制過程中隨時切除不正常的核柑酸。
上述修復(fù)中前3種屬無錯誤修復(fù)，使誘變作用降低。而SOS修復(fù)屬易誤修復(fù)，造成誤差修復(fù)，引起突變。
3節(jié)：突變與育種
菌種工作包括三方面：選種、育種、復(fù)壯和保藏。
選種-從自然界和生產(chǎn)中選擇符合需要菌種。
育種-進一步提高已有菌種某種性能，使更符合要求。
選育新菌種可從幾方面著手：
1）從原有菌株入手進行各種遺傳改造工作。
2）根據(jù)文獻資料報導(dǎo)的微生物種屬，向國內(nèi)外菌種保藏機構(gòu)索取同種或同屬菌株，從中尋求符合要求者。
3）根據(jù)所需菌種特性、嗜好或工藝要求，從特定的生態(tài)環(huán)境中以特定方法重新分離自然菌株。
（一）從自然界分離菌種（菌種分離與篩選）
一般步驟：（插入）
一、采樣
主要以土壤為樣品，一般采5-20cm深處土，須記錄日期、地點、環(huán)境情況等。要根據(jù)篩選目的、微生物分布、菌種特性以及與之有關(guān)的環(huán)境，綜合考慮，具體分析來決定。
二、增殖培養(yǎng)（富集培養(yǎng)）
實際上是初篩濃縮，方法主要是：
1、控制營養(yǎng)成分；2、控制培養(yǎng)條件。
菌種篩選主要步驟
調(diào)查研究及查閱充分的資料
↓
設(shè)計實驗方案
↓確定采集樣品的生態(tài)環(huán)境
采樣
↓確定特定的增殖條件
增殖培養(yǎng)
↓確定特殊的選擇培養(yǎng)基及可能的
↓定性或半定量快速檢出法
平板分離
↓
原種斜面
↓確定發(fā)酵培養(yǎng)基礎(chǔ)條件
篩選
↓
初篩（1株1瓶）
↓
復(fù)篩（1株3～5瓶）
↓結(jié)合初步工藝條件摸索
再復(fù)篩（1株3～5瓶）
↓
3～5株
↓
單株純種分離
↓ 生產(chǎn)性能試驗
↓→毒性試驗
菌種鑒定
三、分離
目的微生物不純，需分離純化。采用簡便迅速，有一定準(zhǔn)確性的檢出方法，提高篩選效率。常用平皿反應(yīng)法：
紙片培養(yǎng)顯色法：浸有指示劑濾紙。
透明圈法：混濁底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸鈣等。
變色圈法：直接用顯色劑或指示劑。
生長圈法：利用某些具有特殊營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，要分離的微生物能在一般培養(yǎng)條件下生長而合成該營養(yǎng)物而使工具菌能生長，形成生長圈。
抑制圈法：瓊脂塊培養(yǎng)法。
四、篩選
即進行生產(chǎn)性能測定，確定適合生產(chǎn)要求菌種。
一般初篩、復(fù)篩、再復(fù)篩，少數(shù)幾株進行全面考察。
篩選時培養(yǎng)條件確定是關(guān)鍵，培養(yǎng)基組成、通風(fēng)、pH、溫度等應(yīng)根據(jù)菌株性能、產(chǎn)物代謝途徑、類似產(chǎn)品的培養(yǎng)條件及前人的工作進行綜合考察，慎重選定。
初篩一株一瓶，取其中10-20%復(fù)篩，一株3瓶，直至最后3-5株，廣泛考察。
（二）自發(fā)突變與育種
一、生產(chǎn)育種
二、定向育種
用某一特定環(huán)境長期處理某一微生物群體，同時不斷地進行移種傳代，以達到積累和選擇合適的自發(fā)突變體的一種古老育種方法。
近年發(fā)展代謝類似物的梯度培養(yǎng)皿法。
（三）誘變育種
利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細胞群，促進其突變率大幅度提高，然后設(shè)法采用簡便、快速、高效的篩選方法，從中挑選少數(shù)符合目的的突變株，以供生產(chǎn)科研之用。
基本工作步驟：
基本步驟
原種 （出發(fā)菌株） → 純化→斜面→同步培養(yǎng)→離心洗滌→振蕩打散→過濾→菌懸液
→誘變處理 → 平板分離 → 斜面 → 斜面→ 斜面 →保藏及擴大試驗
（活菌計數(shù)） （計數(shù)） （變異率）（初篩） （復(fù)篩） （再復(fù)篩）
一、出發(fā)菌株的選擇
用作出發(fā)菌株有：野生型菌株；生產(chǎn)菌株；經(jīng)過誘變的菌株。
一般要求生長快，營養(yǎng)要求粗放，發(fā)育早，產(chǎn)孢子多，對誘變劑敏感性高，已能積累少量產(chǎn)品或前體物的菌株。
二、菌懸液制備
一般采用單孢子或單細胞懸液。
誘變劑一般只作用與DNA的一條鏈，發(fā)生變異無法反映在當(dāng)代表型上，只有經(jīng)過DNA復(fù)制和細胞分裂后，才會使表型發(fā)生變異，此即表型延遲。
制備菌懸液時要注意生理狀態(tài)、均一性、細胞濃度、菌懸液介質(zhì)（生理鹽水或緩沖液）。
三、誘變處理
1、常用誘變劑：
物理誘變劑：紫外線（UV）、X射線、r射線、快中子（0.2-10Mev）。
化學(xué)誘變劑：硫酸二乙酯DES，甲基磺酸乙酯EMS，亞硝基胍NTG。
總結(jié)表
2、誘變劑量：
誘變劑作用：提高突變率；擴大產(chǎn)量變異幅度；使變異朝正變或負變方向移動。
凡是在高誘變率基礎(chǔ)上，既能擴大變異幅度，又能使變異移向正變范圍的劑量就是合適劑量。圖8-21
3、處理方法：
采用復(fù)合處理，包括誘變劑先后使用，同時使用和重復(fù)使用，提高效果。
表8-8
四、變異菌株的分離和篩選
誘變處理后一般要經(jīng)過后培養(yǎng)和變異株篩選。
一般將篩選分為初篩和復(fù)篩。
初篩重點在于分離培養(yǎng)盡可能多菌株，采用預(yù)先設(shè)計的相同培養(yǎng)條件，以量為主，準(zhǔn)確性其次，減少漏篩機會。
復(fù)篩以質(zhì)為主，反復(fù)多次。
高效篩選方案：
尋找利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與生產(chǎn)性狀間的相關(guān)性。
篩選抗生素生產(chǎn)菌時，可采用瓊脂塊培養(yǎng)法：圖8-22
（四）營養(yǎng)缺陷型篩選
基本培養(yǎng)基（MM，[-]）：凡能滿足某一菌種野生型和原養(yǎng)型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的組合培養(yǎng)基。
完全培養(yǎng)基（CM，[+]）：在基本培養(yǎng)基中加入一些富含生長因子的物質(zhì)，以滿足該微生物各種營養(yǎng)缺陷型要求。
補充培養(yǎng)基（SM，[X]）：在基本培養(yǎng)基中有針對性地加上某一種或幾種其自身不能合成的成分，以滿足相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型生長的培養(yǎng)基。
營養(yǎng)缺陷型表示：所要求的營養(yǎng)物的頭三個字母表示，如bio-，對應(yīng)的野生型以bio+表示。
一般步驟：
1、誘變處理
2、淘汰野生型：抗生素法、菌絲過濾法。
3、檢出缺陷型：方法有
1）夾層培養(yǎng)法：圖8-23。
2）限量補充培養(yǎng)法：含微量蛋白胨（0.01%）的[一]上。
3）逐個檢出法：分別接種到[-]和[+]上。
4）影印接種法：[+]培養(yǎng)，影印至[-]上。
4、鑒定缺陷型：
1）生長譜法：缺陷型斜面培養(yǎng)后，制成菌懸液涂布于[-]上，平板上劃成不同區(qū)域，分別加上一種所需測驗的營養(yǎng)物，培養(yǎng)觀察。
2）組合補充培養(yǎng)基法：菌株較多時用。
營養(yǎng)缺陷型應(yīng)用
1、標(biāo)記菌種：代謝途徑、雜交、基因重組中。
2、生物測定用菌
3、生產(chǎn)菌株：前體積累。
（五）抗性突變株篩選
1、一次性篩選：在對于出發(fā)菌株完全致死的環(huán)境中一次性篩選少數(shù)抗性突變株。
2、階梯性篩選：使用濃度梯度與某一空間或時間。
空間-梯度培養(yǎng)皿法：圖8-18。
時間-類似于馴化。
4節(jié):基因重組與雜交育種
雜交hybridization：兩個性狀不同的菌株或變種之間進行細胞結(jié)合，遺傳物質(zhì)交換重新組合成新的性狀。
基因重組gene
recombination：兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子的重新組合后，形成新遺傳型個體的方式。
第四章：微生物生長
生長：有機體的細胞組分與結(jié)構(gòu)在量方面的增加。
繁殖：單細胞-由于細胞分裂引起個體數(shù)目的增加。
多細胞-通過無性或有性孢子使個體數(shù)目增加的過程。
發(fā)育：適合條件下，生長與繁殖始終是交替進行的，從生長到繁殖是一個由量變到質(zhì)變的過程，這個過程稱為發(fā)育。
1節(jié)：微生物的發(fā)育周期
一、概念
發(fā)育周期、單細胞微生物、絲狀真菌
二、發(fā)育周期中細胞學(xué)上變化
1、細胞壁與質(zhì)膜的延伸
質(zhì)膜合成位點在赤道帶，細胞壁生長也定位在赤道區(qū)，并具有種的特異性。
2、DNA的復(fù)制
1）單向復(fù)制 John Cairns：E. Coli作材料，放射自顯影技術(shù)。染色體從起始點開始，反時針旋轉(zhuǎn)一周完成。
2）雙向復(fù)制 Hiroshi Yoshikawa：不只按一個方向復(fù)制，起點與終點不重合。
3）滾環(huán)模型：不對稱復(fù)制。一股線狀，一股環(huán)狀復(fù)制。
真核微生物復(fù)制有多個位點，都是雙向。
3、發(fā)育循環(huán)中基因的表達
DNA的復(fù)制與細胞分裂是協(xié)調(diào)的。細胞分裂總是發(fā)生在DNA復(fù)制后的一定時間內(nèi)。抑制DNA合成的各種化學(xué)處理或突變也抑制細胞分裂。細菌DNA復(fù)制需DNA起始蛋白作用。
E. coli 細胞分裂總是發(fā)生在DNA復(fù)制完成后大約20分鐘，而DNA復(fù)制需40分鐘，這樣世代時間應(yīng)是60分鐘，但…...
三、細胞分化現(xiàn)象
在某些微生物的發(fā)育循環(huán)中，一個或一群細胞會從一種形態(tài)與功能轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N形態(tài)與功能，此稱細胞分化或形態(tài)發(fā)生。
2節(jié)：微生物純培養(yǎng)的生長
一、純培養(yǎng)的分離方法 表
二、生長測定（適用、注意事項）
直接計數(shù)法（全數(shù)）
間接計數(shù)法（活菌數(shù)）
測細胞物質(zhì)量
三、細菌純培養(yǎng)群體生長規(guī)律
將少量純培養(yǎng)接種到一恒定體積的新鮮液體培養(yǎng)基中，適宜條件下培養(yǎng)，定時取樣測定細菌含量，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以細菌數(shù)目的對數(shù)或生長速率為縱坐標(biāo)，得繁殖曲線，對單細胞而言，又稱生長曲線。
根據(jù)生長速率不同，分為幾個時期。
（一）延遲期 lag phase(停滯期、調(diào)整期）
表現(xiàn)：不立即繁殖，生長速率近于0，菌數(shù)幾乎不變，細胞形態(tài)變大。
特點：分裂遲緩，合成代謝活躍，體積增長快，對外界不良環(huán)境敏感。
原因：調(diào)整代謝，合成新的酶系和中間代謝產(chǎn)物以適應(yīng)新環(huán)境。
消除：增加接種量；采用最適菌齡接種；培養(yǎng)基成分（種子、發(fā)酵）
（二）對數(shù)期 log phase
表現(xiàn)：代謝活性最強，幾何級數(shù)增加，代時最短，生長速率最大。
特點：細菌數(shù)目增加與原生質(zhì)總量增加，與菌液濁度增加呈正相關(guān)性。
代時（generation time）：單個細胞完成一次分裂所需時間，亦即增加一代所需時間。
G=t1-t0/n y=xo2n n=lgy - lgx/lg2
導(dǎo)出 G = t1 - t0 /3.3(lgy - lgx)
影響G因素：菌種、營養(yǎng)成分、營養(yǎng)物濃度（很低時影響）、培養(yǎng)溫度。
（三）穩(wěn)定期 stationary phase(最高生長期、靜止期）
表現(xiàn)：新增殖細胞數(shù)與老細胞的死亡數(shù)幾乎相等，活菌數(shù)動態(tài)平衡。
特點：生長速率又趨于0，細胞總數(shù)最高。
原因：養(yǎng)分減少；有毒代謝物產(chǎn)生。
穩(wěn)定期細胞內(nèi)開始積累貯存物，此階段收獲菌體，也是發(fā)酵過程積累代謝產(chǎn)物的重要階段。
延長：補料，調(diào)pH、溫度等。
此時，菌體總數(shù)量與所消耗的營養(yǎng)物之間存在一定關(guān)系，稱為產(chǎn)量常數(shù)（生長效率）。Y = X - X0 /C
其中X-穩(wěn)定期細胞干重/ml， X0 -接種時干重/ml，C-限制性營養(yǎng)物濃度。
根據(jù)這一原理，可進行生物測定。
將未知混合物加到只缺乏特定限制性營養(yǎng)物的完全培養(yǎng)基中，測定培養(yǎng)基所能達到的生長量，就可以計算出原混合物中特定限制性營養(yǎng)物的濃度。
（四）衰亡期 decline phase
表現(xiàn)：出現(xiàn) "負生長 "，有些細胞開始自溶。
對于絲狀真菌，細胞數(shù)目不呈幾何級數(shù)增加，無對數(shù)生長期，一般有調(diào)整期，最高生長期，衰退期。
四、連續(xù)培養(yǎng) continuous cultivation
分批培養(yǎng) batch culture ：將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)生長，最后一次收獲。
若不斷補充新鮮營養(yǎng)，并及時不斷以同樣速度排出培養(yǎng)物，則可延長對數(shù)期。
只要培養(yǎng)液的流動量能使增殖的新菌數(shù)相當(dāng)于流出的老菌數(shù)，就可保證總菌量不變，此即連續(xù)培養(yǎng)原理。
主要參數(shù)：D（稀釋率）=F（流動速率）/V（容積）
連續(xù)培養(yǎng)方法
1、恒濁連續(xù)培養(yǎng) turbidostat
不斷調(diào)節(jié)流速使培養(yǎng)液濁度保持恒定。
裝置
適用：收獲菌體及與菌體相平行的產(chǎn)物。
2、恒化連續(xù)培養(yǎng) chemostat
恒定流速，及時補充營養(yǎng)，營養(yǎng)物濃度基本恒定，從而保持恒定生長速率。又稱恒組成連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分中，必須將某種必需的營養(yǎng)物控制在較低的濃度，以作為限制性因子，而其它營養(yǎng)物過量。常用的有氨、氨基酸、葡萄糖、生長因子、無機鹽等。
適用；科研
兩種方法比較：
五、同步生長 synchronous growth
概念：使所有的細胞都能處于同一生長階段，同時分裂的生長方式。
同步培養(yǎng)法獲得：
（一）機械法（選擇法）
1、離心沉降分離法
2、過濾分離法
3、硝酸纖維素薄膜法
（二）調(diào)整生理條件法（誘導(dǎo)法）
1、溫度調(diào)整法：亞適生長溫度-->最適生長溫度培養(yǎng)。
2、營養(yǎng)條件調(diào)整法：控制濃度或組成，使細胞只能進行一次分裂。
3、用穩(wěn)定期的培養(yǎng)物接種：穩(wěn)定期細胞處于衰老狀態(tài)，移入新鮮培養(yǎng)基，可得同步生長。
（三）抑制DNA合成法
DNA合成是細胞分裂前提。抑制一段時間再解除抑制。
3節(jié)：環(huán)境條件對生長影響
一、溫度
影響兩方面。
最低、最適、最高生長溫度，致死溫度。
微生物生長溫度類型：
低溫型（嗜冷微生物）
中溫型（嗜溫微生物）
高溫型（嗜熱微生物）
二、pH
主要影響：引起膜電荷變化，從而影響營養(yǎng)吸收；影響酶活性；改變營養(yǎng)物狀態(tài)和有害物毒性。
有最適pH，此時酶活性最高，其他條件適合，生長速率最高，但不是生產(chǎn)的最適pH。
微生物細胞內(nèi)的pH多接近于中性。
pH調(diào)節(jié)措施：
三、氧化還原電位 Eh
Eh與氧分壓有關(guān)，也與pH有關(guān)。
不同種類微生物所要求的Eh不同。
Eh影響酶活性，也影響呼吸作用。
四、輻射
指通過空氣或外層空間以波動方式從一個地方傳播或傳遞到另一個地方的能量。
（一）紫外線（非電離輻射）10-380nm
致死主要是細胞中很多物質(zhì)對紫外線吸收。殺菌作用隨劑量增加而增加。紫外線穿透力弱，應(yīng)用于空氣消毒、表面消毒、菌種誘變。
（二）電離輻射（X、α、β、γ）
效應(yīng)無專一性， α、β穿透力較弱，X、 γ較強。
KI對電離輻射具保護作用。
五、干燥
水分對正常生長必不可少，各種微生物抵抗干燥能力不同。
六、滲透壓
微生物對滲透壓有一定適應(yīng)能力。高滲溶液-質(zhì)壁分離，低滲溶液-細胞膨脹破裂。
七、超聲波（20，000Hz以上）
使細胞破裂，科研中破碎細胞。
八、表面張力
4.5--6.5x10-4 N/cm，降低影響。
4節(jié)：滅菌與消毒
滅菌 sterilization ：殺死所有微生物。
消毒 disinfection ：殺死一切病原微生物。
防腐 antisepsis：利用理化因素抑制微生物生長繁殖。
化療 chemotherapy：利用具有選擇毒性化學(xué)藥物或抗生素來抑制宿主體內(nèi)病原微生物的生長繁殖，借以達到治療的一種措施。
一、常用滅菌消毒方法
1、干熱滅菌法
火焰滅菌（灼燒滅菌）、干熱滅菌
2、濕熱滅菌
巴氏消毒、煮沸消毒、高壓蒸汽滅菌、間歇加熱滅菌、實罐滅菌
3、過濾除菌
4、放射線滅菌
二、常用的消毒劑
理想的消毒劑：殺菌力強，使用方便；價廉；對人、畜無害；能長期保存；溶解度大；無腐蝕性等。
消毒劑種類：氧化劑、重金屬鹽、有機化合物
相對藥效：
三、影響滅菌與消毒因素
1、微生物種類
2、培養(yǎng)基
3、消毒劑
4、環(huán)境因素
5節(jié)：化學(xué)療劑對微生物作用
能直接干擾病原微生物的生長繁殖并可用于治療感染性疾病的化學(xué)藥物。
化學(xué)療劑能選擇性地作用于病原微生物新陳代謝的某個環(huán)節(jié)，使其生長受到抑制或致死。
一、抗代謝物
結(jié)構(gòu)上類似，競爭性地與酶結(jié)合，只有當(dāng)正常代謝物量少或不存在時才起作用。
最常用的是磺胺類藥物。是氨苯磺胺衍生物，其結(jié)構(gòu)與對氨基苯甲酸（PABA）類似，而PABA是葉酸分子組成。葉酸是輔酶，在氨基酸、維生素合成中起重要作用，許多細菌需自己合成葉酸，而人和動物利用現(xiàn)成葉酸，因此不受磺胺干擾。
還有異煙肼rimifon，是吡哆醇對抗物。
二、抗生素
作用范圍：抗菌譜
作用位點：
1、抑制細胞壁合成：青霉素，多氧霉素
2、影響細胞膜功能：多肽類，多烯類
3、干擾蛋白合成：抑制而非殺死
4、阻礙核酸合成：對細胞有毒
三、微生物抗藥性
對藥物的適應(yīng)性即是抗藥性。
抗藥性主要表現(xiàn)（產(chǎn)生機制）
1、菌體內(nèi)產(chǎn)生鈍化或分解藥物的酶
2、改變膜的透性而導(dǎo)致抗藥性產(chǎn)生
3、被藥物作用的部位發(fā)生改變
4、形成救護途徑。
五章：微生物遺傳
遺傳heredity-親代將其特有的生物學(xué)特性傳遞給子代。
遺傳性-子代總保持與親代相同的生物學(xué)特性。
遺傳型genotype-生物體所具有的全套遺傳物質(zhì)總稱。又稱基因型。
表型phenotype-特定環(huán)境中生物體表現(xiàn)出的種種形態(tài)與生理特征。
變異variation- 遺傳型的改變。
適應(yīng)或飾變modification-表型的改變。
基因-指帶有足以決定一個蛋白質(zhì)全部組成所需信息的最短DNA片段。
菌株&克隆-指一組遺傳型相同的細胞群。
微生物在遺傳上特點：
1、微生物細胞結(jié)構(gòu)簡單，營養(yǎng)體一般為單倍體，方便建立純系。
2、很多常見微生物都易于人工培養(yǎng)，快速、大量生長繁殖。
3、對環(huán)境因素的作用敏感，易于獲得各類突變株，操作性強。大多是無性生殖，變異易保留。
1節(jié)：遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)
一、證明經(jīng)典實驗
（一）轉(zhuǎn)化實驗
1928，Griffith首次發(fā)現(xiàn)Streptococcus pneumoniae的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。
1944，Avery等在離體條件下重復(fù)這一實驗，并對轉(zhuǎn)化本質(zhì)進行了研究。
終于證明了DNA是遺傳物質(zhì)。
Griffith轉(zhuǎn)化實驗：
Avery轉(zhuǎn)化實驗
（二）噬菌體T2的感染實驗
1952，Hershey & Chase 用E. coli, phage T2做材料，利用同位素示蹤法進行實驗。
蛋白質(zhì)只含S不含P，DNA只含P不含S，分別用35S、32P標(biāo)記E. coli, 用T2感染，得到35ST2、32PT2。
實驗過程（插入）
（三）病毒拆開與重建實驗
1956，F(xiàn)raenkel & Conrat
用TMV（煙草花葉病毒）和HRV（霍氏車前病毒）進行實驗，說明遺傳信息在RNA中。
（插入）
二、遺傳物質(zhì)在細胞中存在方式
（一）細胞水平
（二）核水平（plasmid）
（三）染色體水平
（四）核酸水平
（五）基因水平（遺傳功能單位）
（六）密碼子水平（遺傳信息單位）
（七）核苷酸水平（最低突變或交換單位）
染色體外遺傳物質(zhì)-質(zhì)粒
染色體外，獨立存在的，能自主復(fù)制的遺傳物質(zhì)。
雙股環(huán)狀DNA，可游離存在，也可整合到宿主DNA上。
吖啶類染料、高溫、某些離子作用可消除質(zhì)粒。
附加體episome：質(zhì)粒插入到染色體上和染色體一起復(fù)制。
質(zhì)粒種類
1、F因子（致育因子）：大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，含質(zhì)粒為F+（♂）；無質(zhì)粒為F-（♀）；質(zhì)粒DNA整合到染色體上為Hfr.
2、R因子（耐藥性）：痢疾桿菌，多價耐藥性，耐藥信息攜帶在質(zhì)粒上。
3、Col因子（大腸桿菌素產(chǎn)生因子）
4、青霉素酶質(zhì)粒
5、Ti質(zhì)粒（誘癌質(zhì)粒）：植物根癌，植物基因工程重要載體。
6、降解質(zhì)粒：Pseudomonas
隱蔽質(zhì)粒、表達質(zhì)粒、分泌質(zhì)粒等。 ←
2節(jié)：基因突變
突變mutation-遺傳物質(zhì)核酸中的核苷酸順序突然發(fā)生了可遺傳的變化。
包括基因突變（點突變）-由于DNA鏈上的一對或少數(shù)幾對堿基發(fā)生改變而引起。
染色體畸變-DNA的大段變化現(xiàn)象，表現(xiàn)為插入、缺失、重復(fù)、易位、倒位。
由于重組或附加體等外源遺傳物質(zhì)的整合而引起的DNA改變，不屬突變范圍。
一、基因突變
（一）類型
按突變體mutant表型 特征不同
1、形態(tài)突變型：細胞或菌落形態(tài)改變。
2、生化突變型：代謝途徑變異
營養(yǎng)缺陷型-由基因突變引起某酶合成能力喪失，必須在原有培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能生長。
抗性突變型-能抵抗有害理化因素，包括抗藥性、抗噬菌體等。
抗原突變型-細胞成分尤其是表面成分的細致變異。
3、致死突變型：基因突變導(dǎo)致個體死亡。
4、條件致死突變型：在某一條件下呈現(xiàn)致死效應(yīng)，如溫度敏感突變型。
如果從研究者能否從巨大群體中迅速檢測和分離出個別突變體的目的來看，則只有兩類突變：
選擇性突變-具有選擇性標(biāo)記，可通過某種環(huán)境條件使它們得到優(yōu)勢生長，從而取代原始菌株。
非選擇性突變-無選擇性標(biāo)記，而只有一些性狀的數(shù)量差別，如菌落大小、顏色深淺、代謝物產(chǎn)量等。
（二）特點
1、不對應(yīng)性：
突變的性狀與引起突變的原因間無直接的對應(yīng)關(guān)系。
相應(yīng)的環(huán)境僅起著淘汰原有非突變型個體的作用，如果說其有誘變作用，也可以誘發(fā)任何性狀的變異，而不是專一性地誘發(fā)一種變異。
2、自發(fā)性：
各種突變可以在沒有人為的誘變因素下自發(fā)發(fā)生。
3、稀有性：
自發(fā)突變頻率較低，一般10-6?10-9 。
突變率- 每個細胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率�；蛎繂挝蝗后w在繁殖一代過程中形成的突變體的數(shù)目。
一個細胞長大分裂成兩個細胞的過程稱為細胞世代。
細胞世代數(shù)=n-n0, 對于非同步生長來說，對數(shù)生長期，平均世代數(shù)= n-n0 /Ln2, m 為n-n0 期突變體數(shù)目，
突變率= m
n-n0 /Ln2
測定m的簡單辦法是將一細胞群體培養(yǎng)在平板上，讓突變在平板培養(yǎng)中發(fā)生。這種情況下，每一突變產(chǎn)生一固定在原位的突變體克隆，經(jīng)適當(dāng)處理可以以單一菌落狀態(tài)檢出。
非選擇性突變的突變率很難測定。
4、獨立性：
突變的發(fā)生一般是獨立的，某一基因的突變，既不提高也不降低其他基因的突變率。突變不僅對某一細胞是隨機的，而且對某一基因也是隨機的。
5、誘變性：
誘變劑作用可提高突變率。
6、穩(wěn)定性：
遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生的穩(wěn)定變化，因而產(chǎn)生的新性狀也是穩(wěn)定的，可遺傳的。
7、可逆性
野生型?突變型，為正向突變
野生型?突變型，為回復(fù)突變（回變）。
（三）自發(fā)性與不對應(yīng)性的證明
突變是通過適應(yīng)而產(chǎn)生的，突變的原因與性狀間是相對應(yīng)的。
突變是自發(fā)的，與環(huán)境是不相對應(yīng)的。
1、變量試驗（1943，Luria & Delbruck）
實驗要點：（插入）
結(jié)果：甲各皿抗性菌落數(shù)相差較大，乙各皿數(shù)基本相同。
說明：抗性突變不是由噬菌體誘導(dǎo)出來的。
如果是噬菌體誘導(dǎo)的話，結(jié)果會怎樣？
突變發(fā)生在什么時間？
噬菌體起什么作用？
2、涂布試驗（1949，Newcombe設(shè)計）
實驗要點（插入）
說明：抗性突變發(fā)生在未接觸噬菌體之前，噬菌體加入只起篩選作用。
如果不是這樣，結(jié)果會怎樣？
3、影印培養(yǎng)試驗（1952，Lederberg設(shè)計）
影印培養(yǎng)法-使在一系列培養(yǎng)皿相同位置上能出現(xiàn)相同菌落的一種接種培養(yǎng)方法。
利用此法可以從在非選擇性條件下生長的群體中，分離出各類突變體。
實驗要點：（插入）
結(jié)果：3上出現(xiàn)抗性菌落，在2上找出相應(yīng)菌落接種到含藥平板上，長出抗性菌落。而取與3上無對應(yīng)關(guān)系的菌落接種到含藥平板上則無生長。
（四）突變機制
1、誘變機制 induce mutation , mutagen
1）堿基對置換（點突變）
只涉及一對堿基被另一對堿基所置換，分為轉(zhuǎn)換和顛換。
①直接引起置換的誘變劑
可直接與堿基發(fā)生反應(yīng)，不論在體內(nèi)還是離體都起作用。包括亞硝酸、羥胺和各種烷化劑（硫酸二乙酯、NTG等）。
以HNO2為例：
HNO2 可使堿基氧化脫氨，使A→H，C→U，G→X。
AT→HeT HkC HkC
②間接引起置換的誘變劑
一些堿基結(jié)構(gòu)類似物，但穩(wěn)定性比正常堿基小，易發(fā)生互變。通過活細胞的代謝活動摻入到DNA中，只對正在生長發(fā)育的細胞有作用，即DNA復(fù)制時起作用。
主要是5-BU，5-AU，2-AP，8-NG等。
以5-BU為例：
AT A:5-BU(酮式） AT GC
AT G:5-BU(烯醇式） A:5-BU(酮式）
還可以看出5-BU摻入引起GC回復(fù)至AT的過程。
堿基對置換對密碼子影響
簡拼 UCG(Ser)（不表現(xiàn)突變現(xiàn)象）
錯義 UAC(Tyr)
UCC 錯義 UUC(Phe) (所合成蛋白質(zhì)
(Ser) 有活性或純化)
無義 UAA(終止符)（合成一些蛋白質(zhì)碎片）
2）移碼突變
由一種誘變劑引起DNA分子中一個或少數(shù)幾個核苷酸的增添或缺失，從而使該部位后面的全部密碼的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯發(fā)生錯誤。也屬于DNA分子的微小損傷。
主要是吖啶類染料，一系列ICR化合物。
在DNA鏈上增缺1、2、4、5堿基，可引起移碼突變，增缺3、6，則不影響讀碼，只引起短的缺、增。
3）染色體畸變
DNA分子大的損傷。
①數(shù)量變化：真核有倍數(shù)性變化和非倍數(shù)性變化；原核只一條染色體，獲得一段DNA，形成部分二倍體。
②結(jié)構(gòu)變化：又分染色體內(nèi)與染色體間畸變（非同源染色體間易位）。
4）轉(zhuǎn)座因子 transposible element
1940`s B. McClintock 玉米遺傳研究發(fā)現(xiàn)染色體易位。
在染色體組中或染色體組間能改變自身位置的一段DNA序列稱作轉(zhuǎn)座因子。
有三類：
插入序列 IS：0.7-1.4 kb，只能引起轉(zhuǎn)座效應(yīng)，不含其它基因。
轉(zhuǎn)座子 Tn ：2-2.5 kb，含有幾個至十幾個基因。
Mu噬菌體：37 kb，含有20多個基因。
2、自發(fā)突變機制
Spontanous mutation：指微生物在沒有人工參與下發(fā)生的突變。
1）背景輻射和環(huán)境因素的誘變：低劑量長期效應(yīng)。輻射、高溫、低濃度誘變劑。
2）自身代謝產(chǎn)物的誘變：H2O2-內(nèi)源誘變劑。
3）互變異構(gòu)效應(yīng)：T、G酮式或烯醇式，A、C氨基式或亞氨基式。一般傾向于酮式和烯醇式。T以烯醇式與G配對，C以亞氨基式與A配對。
4）環(huán)出效應(yīng)：DNA復(fù)制過程中偶爾環(huán)出。
（五）紫外線對DNA的損傷及機體對損傷DNA的修復(fù)
紫外線作用：同鏈DNA的相鄰T間形成共價T二聚體，阻礙堿基間正常配對，從而引起突變或死亡。
機體對損傷DNA的修復(fù)：
1、光復(fù)活作用：經(jīng)UV照射后的微生物暴露于可見光下，可明顯降低起死亡率，此稱光復(fù)活作用。
2、暗修復(fù)作用（切補修復(fù)）：與光無關(guān)，須4種酶參與：核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶。
3、重組修復(fù)：發(fā)生在DNA復(fù)制過程或復(fù)制之后，不切除DNA損傷部位的修復(fù)。DNA鏈在復(fù)制時，受損的模板作用消失，互補單鏈（新鏈）里留下空隙，產(chǎn)生誘導(dǎo)信號，recA基因被誘導(dǎo)，產(chǎn)生大量重組蛋白，與新鏈缺口結(jié)合，引起
子鏈和母鏈交換。交換后母鏈缺口，通過聚合作用，以對側(cè)子鏈為模板合成DNA 片段填充，連接酶連接新舊鏈完成復(fù)制。
4、SOS修復(fù) ：一種能夠引起誤差修復(fù)的緊急呼救修復(fù)，是在無模板DNA
情況下合成酶的誘導(dǎo)修復(fù)。正常情況下無活性有關(guān)酶系，DNA受損傷而復(fù)制又受到抑制情況下發(fā)出信號，激活有關(guān)酶系，對DNA損傷進行修復(fù)，其中DNA多聚酶起重要作用，在無模板情況下，進行DNA修復(fù)再合成，并將DNA片段插入受損DNA空隙處。
5、DNA 多聚酶的校正作用：DNA
多聚酶除了對多核苷酸的多聚作用外，還具有3`到5`核酸外切酶作用，依靠這一作用，能在復(fù)制過程中隨時切除不正常的核柑酸。
上述修復(fù)中前3種屬無錯誤修復(fù)，使誘變作用降低。而SOS修復(fù)屬易誤修復(fù)，造成誤差修復(fù)，引起突變。
3節(jié)：突變與育種
菌種工作包括三方面：選種、育種、復(fù)壯和保藏。
選種-從自然界和生產(chǎn)中選擇符合需要菌種。
育種-進一步提高已有菌種某種性能，使更符合要求。
選育新菌種可從幾方面著手：
1）從原有菌株入手進行各種遺傳改造工作。
2）根據(jù)文獻資料報導(dǎo)的微生物種屬，向國內(nèi)外菌種保藏機構(gòu)索取同種或同屬菌株，從中尋求符合要求者。
3）根據(jù)所需菌種特性、嗜好或工藝要求，從特定的生態(tài)環(huán)境中以特定方法重新分離自然菌株。
（一）從自然界分離菌種（菌種分離與篩選）
一般步驟：（插入）
一、采樣
主要以土壤為樣品，一般采5-20cm深處土，須記錄日期、地點、環(huán)境情況等。要根據(jù)篩選目的、微生物分布、菌種特性以及與之有關(guān)的環(huán)境，綜合考慮，具體分析來決定。
二、增殖培養(yǎng)（富集培養(yǎng)）
實際上是初篩濃縮，方法主要是：
1、控制營養(yǎng)成分；2、控制培養(yǎng)條件。
菌種篩選主要步驟
調(diào)查研究及查閱充分的資料
↓
設(shè)計實驗方案
↓確定采集樣品的生態(tài)環(huán)境
采樣
↓確定特定的增殖條件
增殖培養(yǎng)
↓確定特殊的選擇培養(yǎng)基及可能的
↓定性或半定量快速檢出法
平板分離
↓
原種斜面
↓確定發(fā)酵培養(yǎng)基礎(chǔ)條件
篩選
↓
初篩（1株1瓶）
↓
復(fù)篩（1株3～5瓶）
↓結(jié)合初步工藝條件摸索
再復(fù)篩（1株3～5瓶）
↓
3～5株
↓
單株純種分離
↓ 生產(chǎn)性能試驗
↓→毒性試驗
菌種鑒定
三、分離
目的微生物不純，需分離純化。采用簡便迅速，有一定準(zhǔn)確性的檢出方法，提高篩選效率。常用平皿反應(yīng)法：
紙片培養(yǎng)顯色法：浸有指示劑濾紙。
透明圈法：混濁底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸鈣等。
變色圈法：直接用顯色劑或指示劑。
生長圈法：利用某些具有特殊營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，要分離的微生物能在一般培養(yǎng)條件下生長而合成該營養(yǎng)物而使工具菌能生長，形成生長圈。
抑制圈法：瓊脂塊培養(yǎng)法。
四、篩選
即進行生產(chǎn)性能測定，確定適合生產(chǎn)要求菌種。
一般初篩、復(fù)篩、再復(fù)篩，少數(shù)幾株進行全面考察。
篩選時培養(yǎng)條件確定是關(guān)鍵，培養(yǎng)基組成、通風(fēng)、pH、溫度等應(yīng)根據(jù)菌株性能、產(chǎn)物代謝途徑、類似產(chǎn)品的培養(yǎng)條件及前人的工作進行綜合考察，慎重選定。
初篩一株一瓶，取其中10-20%復(fù)篩，一株3瓶，直至最后3-5株，廣泛考察。
（二）自發(fā)突變與育種
一、生產(chǎn)育種
二、定向育種
用某一特定環(huán)境長期處理某一微生物群體，同時不斷地進行移種傳代，以達到積累和選擇合適的自發(fā)突變體的一種古老育種方法。
近年發(fā)展代謝類似物的梯度培養(yǎng)皿法。
（三）誘變育種
利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細胞群，促進其突變率大幅度提高，然后設(shè)法采用簡便、快速、高效的篩選方法，從中挑選少數(shù)符合目的的突變株，以供生產(chǎn)科研之用。
基本工作步驟：
基本步驟
原種 （出發(fā)菌株） → 純化→斜面→同步培養(yǎng)→離心洗滌→振蕩打散→過濾→菌懸液
→誘變處理 → 平板分離 → 斜面 → 斜面→ 斜面 →保藏及擴大試驗
（活菌計數(shù)） （計數(shù)） （變異率）（初篩） （復(fù)篩） （再復(fù)篩）
一、出發(fā)菌株的選擇
用作出發(fā)菌株有：野生型菌株；生產(chǎn)菌株；經(jīng)過誘變的菌株。
一般要求生長快，營養(yǎng)要求粗放，發(fā)育早，產(chǎn)孢子多，對誘變劑敏感性高，已能積累少量產(chǎn)品或前體物的菌株。
二、菌懸液制備
一般采用單孢子或單細胞懸液。
誘變劑一般只作用與DNA的一條鏈，發(fā)生變異無法反映在當(dāng)代表型上，只有經(jīng)過DNA復(fù)制和細胞分裂后，才會使表型發(fā)生變異，此即表型延遲。
制備菌懸液時要注意生理狀態(tài)、均一性、細胞濃度、菌懸液介質(zhì)（生理鹽水或緩沖液）。
三、誘變處理
1、常用誘變劑：
物理誘變劑：紫外線（UV）、X射線、r射線、快中子（0.2-10Mev）。
化學(xué)誘變劑：硫酸二乙酯DES，甲基磺酸乙酯EMS，亞硝基胍NTG。
總結(jié)表
2、誘變劑量：
誘變劑作用：提高突變率；擴大產(chǎn)量變異幅度；使變異朝正變或負變方向移動。
凡是在高誘變率基礎(chǔ)上，既能擴大變異幅度，又能使變異移向正變范圍的劑量就是合適劑量。圖8-21
3、處理方法：
采用復(fù)合處理，包括誘變劑先后使用，同時使用和重復(fù)使用，提高效果。
表8-8
四、變異菌株的分離和篩選
誘變處理后一般要經(jīng)過后培養(yǎng)和變異株篩選。
一般將篩選分為初篩和復(fù)篩。
初篩重點在于分離培養(yǎng)盡可能多菌株，采用預(yù)先設(shè)計的相同培養(yǎng)條件，以量為主，準(zhǔn)確性其次，減少漏篩機會。
復(fù)篩以質(zhì)為主，反復(fù)多次。
高效篩選方案：
尋找利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與生產(chǎn)性狀間的相關(guān)性。
篩選抗生素生產(chǎn)菌時，可采用瓊脂塊培養(yǎng)法：圖8-22
（四）營養(yǎng)缺陷型篩選
基本培養(yǎng)基（MM，[-]）：凡能滿足某一菌種野生型和原養(yǎng)型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的組合培養(yǎng)基。
完全培養(yǎng)基（CM，[+]）：在基本培養(yǎng)基中加入一些富含生長因子的物質(zhì)，以滿足該微生物各種營養(yǎng)缺陷型要求。
補充培養(yǎng)基（SM，[X]）：在基本培養(yǎng)基中有針對性地加上某一種或幾種其自身不能合成的成分，以滿足相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型生長的培養(yǎng)基。
營養(yǎng)缺陷型表示：所要求的營養(yǎng)物的頭三個字母表示，如bio-，對應(yīng)的野生型以bio+表示。
一般步驟：
1、誘變處理
2、淘汰野生型：抗生素法、菌絲過濾法。
3、檢出缺陷型：方法有
1）夾層培養(yǎng)法：圖8-23。
2）限量補充培養(yǎng)法：含微量蛋白胨（0.01%）的[一]上。
3）逐個檢出法：分別接種到[-]和[+]上。
4）影印接種法：[+]培養(yǎng)，影印至[-]上。
4、鑒定缺陷型：
1）生長譜法：缺陷型斜面培養(yǎng)后，制成菌懸液涂布于[-]上，平板上劃成不同區(qū)域，分別加上一種所需測驗的營養(yǎng)物，培養(yǎng)觀察。
2）組合補充培養(yǎng)基法：菌株較多時用。
營養(yǎng)缺陷型應(yīng)用
1、標(biāo)記菌種：代謝途徑、雜交、基因重組中。
2、生物測定用菌
3、生產(chǎn)菌株：前體積累。
（五）抗性突變株篩選
1、一次性篩選：在對于出發(fā)菌株完全致死的環(huán)境中一次性篩選少數(shù)抗性突變株。
2、階梯性篩選：使用濃度梯度與某一空間或時間。
空間-梯度培養(yǎng)皿法：圖8-18。
時間-類似于馴化。
4節(jié):基因重組與雜交育種
雜交hybridization：兩個性狀不同的菌株或變種之間進行細胞結(jié)合，遺傳物質(zhì)交換重新組合成新的性狀。
基因重組gene
recombination：兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子的重新組合后，形成新遺傳型個體的方式。
二者關(guān)系
一、原核微生物的基因重組
（一）轉(zhuǎn)化 transformation
概念：受體菌直接吸收了來自供體菌的DNA片段，通過交換，把它組合到自己的基因組中，從而獲得供體菌部分遺傳性狀的現(xiàn)象。
轉(zhuǎn)化后的受體菌，稱轉(zhuǎn)化子transformant
DNA-轉(zhuǎn)化因子。
條件：
1、能進行轉(zhuǎn)化的細胞必須是感受態(tài)的。即受體菌最易接收外源DNA片段并實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。
2、DNA一般都是線狀雙鏈DNA，不小于5×105D，轉(zhuǎn)化的片段小于107D，平均含15個基因。
轉(zhuǎn)化頻率較低，一般0.1~1%。
過程：圖8-25
雙鏈DNA結(jié)合→酶促分解、形成片段→一條單鏈降解，一條進入→同源配對、受體相應(yīng)段切除，交換，雜種DNA→復(fù)制、分離、轉(zhuǎn)化子。
圖8-26
轉(zhuǎn)化育種：DNA提取，感受態(tài)細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化。
轉(zhuǎn)染：把噬菌體或其他病毒DNA（RNA）提取出來，用它去感染感受態(tài)的宿主細胞，并產(chǎn)生正常噬菌體或病毒后代。
（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)transduction
概念：通過缺陷噬菌體的媒介，把供體細胞的DNA片段攜帶到受體細胞中，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。
U型管實驗：兩株營養(yǎng)缺陷型LA-22（try-)，溶源性細菌（受體）；LA-2（his-），敏感菌（供體）；溫和性噬菌體P22。結(jié)果在LA-22端出現(xiàn)原養(yǎng)型his+try+。原因？
1、普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)
噬菌體可誤包裹供體菌中任何基因（包括染色體外遺傳物質(zhì)），并使受體菌實現(xiàn)各種性狀的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
1）完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)：
噬菌體誤包入供體菌DNA片段，形成完全不含本身DNA的假噬菌體（一種完全缺陷噬菌體），感染受體菌后，受體不會溶源化，也不會裂解。導(dǎo)入的DNA片段與同源區(qū)配對，通過兩次交換而重組到受體菌DNA上，形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子。
2）流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)
在獲得供體菌DNA片段的受體菌內(nèi)，如果轉(zhuǎn)導(dǎo)的DNA不能進行重組和復(fù)制，其上的基因僅經(jīng)過轉(zhuǎn)錄而得到表達。
此外源DNA能夠保持下去，任何時候只有一個細胞含有它。表型上仍 出現(xiàn)供體菌特征，能在選擇性培養(yǎng)基上形成微小菌落。
2、局限轉(zhuǎn)導(dǎo)
通過某些部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受體菌中的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。
產(chǎn)生機制：不正常切割 圖8-30
溫和噬菌體整合到細菌DNA特定位點上，誘導(dǎo)裂解時，在插入位點兩側(cè)的少數(shù)宿主基因會因偶爾發(fā)生的不正常切割而連在噬菌體DNA上，一起包入噬菌體中，形成部分缺陷噬菌體，無正常噬菌體的溶源性和增殖能力。
Compbell模型
（1）低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（LFT）
E. coli k12的? phage 成熟時，產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體（ ? dgal） 頻率為10-4--10-6
，稱低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。LFT 裂解物在低moi 下感染宿主，可得極少量局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子。
? dgal- 帶有半乳糖基因的? 缺陷噬菌體。
（2）高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（HFT）
E. coli gal-受體菌用高moi的LFT裂解物進行感染時，則凡感染有? dgal 的 細胞，幾乎同時感染有正常? 。
兩種噬菌體可同時整合到受體菌DNA 上，使其成為雙重溶源菌 ，誘導(dǎo)裂解時，正常? 可補償? dgal
所
缺失基因功能，兩個噬菌體同時復(fù)制，產(chǎn)生裂解物中，大體上含等量? 和? dgal。 用低moi 的HFT
裂解物感染宿主，可高頻率轉(zhuǎn)導(dǎo)。
3、溶源轉(zhuǎn)變 lysogenic conversion
當(dāng)溫和噬菌體感染其宿主而使之發(fā)生溶源化時，因噬菌體基因整合到宿主基因上，而使后者獲得了除免疫性以外新性狀的現(xiàn)象，稱溶源轉(zhuǎn)變。
與轉(zhuǎn)導(dǎo)本質(zhì)上不同，噬菌體不攜帶任何供體菌基因，是完整的，而非缺陷的。
普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)與局限轉(zhuǎn)導(dǎo)比較(插入)
（三）接合conjugation
概念：通過供體菌和受體菌完整細胞間的直接接觸而傳遞大段DNA的過程。也稱雜交。
基本原理：
細菌、放線菌中都存在接合現(xiàn)象。放線菌中天藍色鏈霉菌( Streptomyces
coelicolor)研究的最為詳細。細菌中，大腸桿菌研究最清楚。
F+ + F- = F+
F因子傳遞過程-滾環(huán)模型：
Hfr + F- = F-
與F-接合時， Hfr染色體在F因子處發(fā)生斷裂，環(huán)狀變成線狀，轉(zhuǎn)移至 F-
約100分鐘，F(xiàn)因子最后轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移過程中經(jīng)常會發(fā)生斷裂，所以重組頻率高，但很少出現(xiàn)F+ 。
轉(zhuǎn)移過程與F因子傳遞過程基本相同，但進入F-
的單鏈DNA經(jīng)雙鏈化后，形成部分合子，然后同源配對，經(jīng)過兩次或以上的交換才能發(fā)生重組。
中斷雜交實驗
Hfr染色體轉(zhuǎn)移有嚴(yán)格的順序性，實驗中可每隔一定時間利用強烈攪拌等措施，中斷接合，從而獲得呈現(xiàn)不同數(shù)量Hfr性狀的F-
接合子。
根據(jù)在F- 中出現(xiàn)Hfr各種性狀的時間早晚，可以畫出一幅較完整的環(huán)狀染色體圖。
F` 菌株-Hfr菌株的F因子因不正常切割而脫離染色體時，可形成游離的但帶有一小段染色體基因的F因子，稱為F`因子。
此帶有F`因子的菌株-初生F`菌株。
初生F`+ F- =F`（次生F`菌株）
既獲得了F因子，又獲得了來自初生F`菌株的若干遺傳性狀，以這種接合來傳遞供體菌基因的方式，稱F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)。（F-duction）
次生F`菌株中，一部分F因子可重新整合到染色體上，恢復(fù)成Hfr菌株。
接合育種
育種前所選擇的親本必須具有一定的選擇性標(biāo)記，還必須具有F因子，受體菌無F因子，但必須為F因子可親和。
1、菌株準(zhǔn)備
2、雜交
3、重組體檢出
（四）原生質(zhì)體融合 Protoplast Fusion
通過人為方法，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并產(chǎn)生重組子的過程，又稱細胞融合。
1、雜交頻率高
2、受接合型或致育性限制較少，但與親緣性有一定關(guān)系。
3、遺傳物質(zhì)傳遞更完整。
4、存在兩株以上親株同時參與融合可能。
5、可以采用產(chǎn)量性狀較高菌株作融合親株。
6、提高生產(chǎn)性狀的潛力較大。
7、原生質(zhì)體較容易進行轉(zhuǎn)化，可用于工業(yè)微生物育種工作
二、主要步驟
1、原生質(zhì)體制備：
作為育種菌株須：①具有良好生產(chǎn)性狀②具有一些穩(wěn)定的明顯的遺傳標(biāo)記。
一般采用雙標(biāo)記，避免回復(fù)突變干擾。離心收集對數(shù)后期菌體，破壁。原生質(zhì)體低滲中易破裂，使用滲透壓穩(wěn)定劑進行保護。（甘露醇、山梨醇、蔗糖、氯化鉀、氯化鈉等）
離心收集原生質(zhì)體。
2、原生質(zhì)體融合：
加入促融合劑-聚乙二醇（PEG）及Ca2+、Mg2+，使原生質(zhì)體表面形成電極性，相互易于吸引，形成聚集物。UV、電場、激光等技術(shù)可應(yīng)用。
3、再生成正常細胞：
融合后的原生質(zhì)體不具細胞壁，不能在普通培養(yǎng)基上增殖，無法表現(xiàn)，必須使其重新形成壁。再生培養(yǎng)基必須具有與原生質(zhì)體體內(nèi)相同滲透壓，常用含Ca2+、Mg2+及滲透壓穩(wěn)定劑的完全培養(yǎng)基。
檢出融合細胞。
外源基因命運
1、具備復(fù)制的必要因子，能在受體細胞中堅持下去并進行復(fù)制，發(fā)展成部分二倍體無性系。
2、流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
3、被酶解-寄主限制。
4、重組。
二、真核微生物基因重組
（一）有性雜交
一般指性細胞間的接合和隨之發(fā)生染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代的一種方式。
常見有性孢子。
（二）準(zhǔn)性生殖parasexual reproduction
類似于有性生殖但更為原始的一種生殖方式。可使同一生物的兩個不同來源的體細胞經(jīng)融合后，不通過減數(shù)分裂而導(dǎo)致低頻率的基因重組。
主要過程：圖8-37
1、菌絲聯(lián)結(jié)、質(zhì)配。
2、形成異核體。
3、核配。
4、體細胞交換和單倍體化。
體細胞中染色體交換-有絲分裂交換：雙倍體雜合子遺傳性狀不穩(wěn)定，進行有絲分裂過程中，極少數(shù)核中染色體會發(fā)生交換和單倍體化，而形成具有新性狀的單倍體雜合子。
有性生殖與準(zhǔn)性生殖區(qū)別：表8-12
準(zhǔn)性雜交
主要步驟：圖8-38
1、選擇親本：要有選擇性標(biāo)記。
2、強制形成異核體。
3、移單菌落。
4、檢驗穩(wěn)定性。
5、促進變異。然后篩選。
歸納總結(jié)：表8-10
基因工程 gene engineering
5節(jié)：菌種衰退、復(fù)壯和保藏
一、衰退與復(fù)壯
對產(chǎn)量性狀而言，菌種的負變就是衰退，其他原有典型性狀變得不典型了，也是衰退。
一個重要原因是基因突變，與控制生產(chǎn)性狀有關(guān)的基因負變造成生產(chǎn)性狀劣化。培養(yǎng)、保藏條件等也有影響。
（一）衰退的防止
1、控制傳代次數(shù)；
2、創(chuàng)造適宜的培養(yǎng)條件；
3、利用不同類型細胞進行接種傳代；
4、采用有效的菌種保藏方法，加強菌種管理措施。
（二）復(fù)壯
1、純種分離
2、通過宿主體進行復(fù)壯（寄生性微生物）
3、淘汰已退化個體
二、菌種保藏
首先挑選典型優(yōu)良純種，其次創(chuàng)造一個有利于休眠的環(huán)境條件，還要考慮方法的通用性與簡便性。
1、低溫保藏：冰箱、超低溫。
2、干燥保藏：土壤、細砂、硅膠等。
3、隔絕空氣保藏：石蠟油封。
4、凍干保藏：綜合低溫、干燥、真空。
5、活體保藏：病原微生物、病毒。
實驗室常用方法：
菌種保藏機構(gòu)簡介
中國微生物菌種保藏管理委員會CCCCM
1、普通微生物菌種保藏管理中心
中科院北微所（AS）：真菌、細菌
武漢病毒所（AS-IV）：病毒
2、農(nóng)業(yè)微生物菌種
農(nóng)科院土肥所（ISF）
3、工業(yè)微生物菌種
食品發(fā)酵所（IFFI）
4、醫(yī)學(xué)微生物菌種
醫(yī)科院皮研所（ID）：真菌
衛(wèi)生部檢定所（NICPBP）：細菌
醫(yī)科院病毒所（IV）：病毒
5、抗生素菌種
醫(yī)科院醫(yī)藥生物技術(shù)所（IA）
四川抗研所（SIA）：新抗菌種
華藥抗研所（IANP）：生產(chǎn)菌種
6、獸醫(yī)微生物菌種
農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所（CIVBP）
中國典型培養(yǎng)物收藏中心（武漢大學(xué)）
國外
美國典型菌種收藏所（ATCC）
美國農(nóng)業(yè)部北方地區(qū)研究室（NRRL）
日本大阪發(fā)酵研究所（IFO）
荷蘭真菌中心收藏所（CBS）
法國里昂巴斯德研究所（IPL）
西德柯赫研究所（RKI）
蘇聯(lián)科學(xué)院微生物研究所（IM）
六章：微生物生態(tài)與環(huán)境保護
（自然條件下的微生物）
生物圈 biosphere
：地球上有生命活動的范圍，是地球上全部生活有機體與其環(huán)境相互作用的統(tǒng)一整體。是所有生態(tài)系統(tǒng)的總和。
微生物生態(tài)：研究處于環(huán)境之中的微生物，和與微生物相聯(lián)系的物理、化學(xué)和生物等環(huán)境條件，以及它們之間的關(guān)系。
生態(tài)系 ecosystem ：生物與其生境通過能量流動和物質(zhì)循環(huán)所組成的一個整體結(jié)構(gòu)。生物群落是核心。
1節(jié)：自然界中的微生物
一、土壤中微生物
土壤是自然界最適宜微生物生長的環(huán)境，具有微生物所需一切營養(yǎng)物及各種條件。種類主要是異養(yǎng)型種類。
二、水中微生物
種類和數(shù)量要比土壤中少得多。
淡水中微生物主要來源于土壤、空氣、污水或死亡腐敗的動植物體。海水中微生物總量超過陸地。
飲用水標(biāo)準(zhǔn)：每ml水細菌總數(shù)不超過100個，E. coli每升水不超過3個。
三、空氣中微生物
空氣非微生物生長良好環(huán)境。微生物通過各種方式傳入空氣，又隨風(fēng)傳播。
數(shù)量取決于環(huán)境。
潮濕空氣中微生物比干燥空氣中少，因為潮濕空氣中微生物被小水滴帶著沉降下去了。
空氣中菌數(shù)測定：過濾收集，培養(yǎng)計數(shù)。
四、極端環(huán)境微生物
了解這些微生物，可以利用其特殊基因、機能，創(chuàng)造有用新種。
2節(jié)：微生物間以及與其他生物間的關(guān)系
生物間關(guān)系：
一、微生物間關(guān)系
1、互生：較松散聯(lián)合，可以是一方得利，或雙方有利。（混菌培養(yǎng)）
2、共生：緊密結(jié)合在一起，高度發(fā)展時，形成特殊共住體，生理上有分工，組織、形態(tài)上產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)。
地衣：藻類 + 真菌
3、寄生：一種生物生活在另一種生物表面或體內(nèi)，從后者獲得營養(yǎng)。
4、拮抗：一種生物產(chǎn)生不利于另一種生物生存的代謝物質(zhì)或改變環(huán)境條件，抑制甚至殺死另一種生物的現(xiàn)象。
5、捕食：一種生物直接吞食另一種生物。
二、與高等植物關(guān)系
共生：根瘤菌，菌根菌
互生：根際微生物
寄生：植物病原微生物
三、與人及動物關(guān)系
共生：瘤胃微生物，白蟻
互生：人體腸道正常菌群
寄生：病原微生物，寄生于昆蟲（生物殺蟲劑）
擇生生物（悉生生物）：接種有一種或多種已知微生物的無菌動物。
3節(jié)：微生物與自然界中的物質(zhì)循環(huán)
物質(zhì)循環(huán)：一切生物將所需重要化學(xué)元素自非生命物質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)狀態(tài)，再自有生命的物質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉巧奈镔|(zhì)狀態(tài)，如此循環(huán)不已。
微生物既是分解者、消耗者，又是生產(chǎn)者。
一、碳素循環(huán)
微生物作用：1）光和作用 2）分解作用
大氣二氧化碳（0.02%）約6000億噸，植物光合作用年消耗600到700億噸，燃燒年產(chǎn)生50～60億噸，人和動物呼吸產(chǎn)生的二氧化碳僅夠植物光合作用一個月之需，90%二氧化碳由微生物代謝活動產(chǎn)生。
經(jīng)光合作用固定地二氧化碳，大部分以聚糖形式累積在木本、草本內(nèi)。
二、氮素循環(huán)
分子態(tài)氮、有機態(tài)氮、無機態(tài)氮
圖9-6。微生物作用：固氮、硝化、反硝化、氨化、氨同化
三、硫素循環(huán)
元素態(tài)、無機化合態(tài)、有機態(tài)
圖9-7。微生物作用：脫硫、硫酸鹽還原作用（同化性、異化性）、硫化（無機硫氧化）。
四、磷素循環(huán)
自然界無機磷主要是磷酸鈣，有機磷主要是核蛋白、核酸、卵磷脂等，都是非溶性的。
轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄�，主要是微生物作用�?br>
4節(jié)：微生物與環(huán)境保護
當(dāng)有害物質(zhì)濃度超過了生態(tài)系統(tǒng)的凈化能力時，就會造成對生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和機能的破壞，打破生態(tài)系統(tǒng)的平衡，使人類生活的環(huán)境發(fā)生變化，此即環(huán)境污染。
一、微生物對污染物的降解與轉(zhuǎn)化
1、主要污染物
無毒有機物:易被生物降解;
有毒有機物:不易被生物降解。
無毒無機物:一些營養(yǎng)性無機鹽;
有毒無機物:重金屬等Hg As Pb Cd。
2、微生物的降解與轉(zhuǎn)化
對無機污染物的轉(zhuǎn)化
微生物不能降解重金屬，只能使它們發(fā)生形態(tài)之間的相互轉(zhuǎn)化及分散和富集過程。也就是改變金屬在環(huán)境中的存在轉(zhuǎn)態(tài)，從而改變它們的毒性
有機Hg Pb 無機Hg Pb
對有機污染物的降解
農(nóng)藥：主要通過催化作用使農(nóng)藥分子發(fā)生一些結(jié)構(gòu)改變，使其被分解。
石油：多種烴類混合物，多種微生物共同作用，
二、水污染及防治
1、水的污染源
污染指標(biāo)：
COD（化學(xué)需氧量）：使用強氧化劑（高錳酸鉀、重鉻酸鉀）使1L污水中的有機物進行化學(xué)氧化時所消耗的氧的毫克數(shù)。mg/L
BOD5(五日生化需氧量)：20℃時，每L廢水所含有機物在5天內(nèi)進行微生物氧化時所消耗的氧量，mg/L。
2、處理廢水的微生物法
(1) 厭氧處理法（產(chǎn)能型）
采用厭氧消化器把微生物可降解的有機物轉(zhuǎn)化成甲烷、二氧化碳、水和其它氣體的一種處理方法。
過程：三個階段，圖9-11:涉及到的微生物，發(fā)生的反應(yīng)。
(2) 好氧處理法
過程
①活性污泥法（曝氣法）（耗能型）：利用含有好氧微生物的活性污泥，在通氣條件下，使污水凈化的生物學(xué)方法。
活性污泥是一種絮狀污泥，主要是菌膠團形成菌，原生動物，有機和無機膠體以及懸浮物組成。人工培養(yǎng)、馴化獲得。
根據(jù)污水在系統(tǒng)中流動狀況分為推流式和完全混合式。
②生物膜法：以好氧微生物組成的生物膜為凈化主體的生物處理方法。
A、滴濾池法（節(jié)能型）（灑水濾床法）
B、生物轉(zhuǎn)盤法（耗能型）
③氧化塘法（節(jié)能型）（穩(wěn)定塘）：大面積敞開式污水處理池，利用藻菌互生系統(tǒng)來分解有機物，使污水得以凈化。
固體廢物采用堆肥法和沼氣發(fā)酵法。
七章：傳染與免疫
1節(jié)：傳染 infection
非傳染性：生理性、遺傳性等
疾病 病原微生物（病毒、細菌）
傳染性
其它生物（寄生蟲等）
傳染是病原微生物侵入機體后，在機體一定部位生長繁殖，并引起一系列病理生理的過程。
傳染是宿主、病原菌、環(huán)境因素三方面力量作用的結(jié)果。
一、傳染的三種可能結(jié)局
1、隱性傳染
2、帶菌狀態(tài)
3、顯性傳染
傳染病專指顯性傳染。
二、決定傳染結(jié)局的三個因素
（一）病原微生物在傳染免疫中作用
要造成感染，必須能抵抗機體內(nèi)的天然防御機能而不被消滅，并在侵入體內(nèi)后能生長繁殖，擾亂機體的新陳代謝，造成傳染。
要具備一些條件才能傳染（P320）
1、毒力或致病性
某種微生物對一定宿主，在一定條件下引起疾病的能力。
強弱取決于以下因素：
1）侵襲力：與酶（卵磷脂酶、透明質(zhì)酸酶、膠原酶、鏈激酶、凝固酶）和微生物結(jié)構(gòu)（莢膜、菌毛、表面抗原）有關(guān)。
2）毒素
①內(nèi)毒素：多由G-產(chǎn)生，化學(xué)組成為脂多糖。
②外毒素：某些G+分泌到體外的毒性物質(zhì)，化學(xué)組成為蛋白質(zhì)。如破傷風(fēng)毒素、肉毒毒素、白喉外毒素等。
外毒素可用0.3-0.4%甲醛脫毒，成為類毒素（仍保持抗原性）。
內(nèi)、外毒素比較：P322，表10-1
2、數(shù)量
與毒力強弱有關(guān)。多數(shù)病原微生物需要足夠數(shù)量侵入機體，才能發(fā)病。
3、侵入途徑
不同菌侵入途徑不同，只有侵入易感機體的一定部位，才能發(fā)病。
（二）機體在傳染免疫中作用（宿主的免疫力）
1、免疫定義 Immune
機體對體內(nèi)外生物性刺激的反應(yīng)，在正常情況下機體識別異物、排除異物、消滅異物的生理功能。
或者說機體識別自己、排除異己抗原物質(zhì)的一種生理功能。
既有有利一面，也有有害一面。
2、免疫反應(yīng)分類
1）非特異性免疫與特異性免疫
非特異性免疫是機體對所有病原微生物都有防御作用，沒有特殊的選擇性。它受遺傳控制，是機體在長期的種系發(fā)育與進化過程中逐漸建立起來的一系列防衛(wèi)機能，在個體一出生就具有。
又稱天然免疫（先天免疫）
特異性免疫是指機體針對某一種或某一類微生物或其產(chǎn)物所產(chǎn)生的特異性抗力。
是個體在生活過程中通過隱性感染或預(yù)防接種等方式，使抗原與免疫系統(tǒng)的細胞相接觸后而獲得的防衛(wèi)機能。又稱后天獲得性免疫
2）自動免疫與被動免疫
自動免疫是指用人工方法注射抗原（菌苗、疫苗、類毒素），使機體產(chǎn)生免疫功能。
被動免疫是指用人工方法注射抗體（抗毒素、抗血清）而產(chǎn)生對病原體的抵抗力。 3）細胞免疫與體液免疫
細胞免疫是指致敏淋巴細胞與其相應(yīng)抗原作用所產(chǎn)生的特異性免疫。
體液免疫是抗體的免疫作用。
3、免疫的功能
1）生理防御功能（免疫防御）
2）自身穩(wěn)定功能（免疫穩(wěn)定）
3）免疫監(jiān)視作用(及時排除突變細胞。)
（三）環(huán)境因素
P325表解
2節(jié)：非特異性免疫
一、機體的天然屏障作用
1、皮膚和粘膜（體外屏障）
2、內(nèi)部屏障
二、吞噬細胞
白細胞分類：P327，表10-4，圖10-1
1、噬中性粒細胞：吞噬過程。圖10-2
2、巨噬細胞：來源、功能。
三、炎癥反應(yīng)
四、體液因素（正常體液中的抗微生物因素）：P330，表10-5
1、補體系統(tǒng)
補體是存在于正常血清中一組具有酶活性的蛋白，有補充抗體作用能力，其作用無特異性，可與抗原抗體復(fù)合物作用，不能單獨作用于抗原或抗體。補體由巨噬細胞、腸上皮細胞及肝、脾細胞產(chǎn)生。
補體系統(tǒng)由11個血清蛋白構(gòu)成，C1-C9，C1又分C1q、C1r、C1s。是一組酶原，被激活后發(fā)揮作用。
補體攻擊細胞結(jié)果，使膜損傷，導(dǎo)致細胞裂解。促進吞噬作用。與變態(tài)反應(yīng)有關(guān)。
(2)干擾素 interferon IFN
干擾素是一類在同種細胞上具有抗病毒活性的蛋白質(zhì)，其活性發(fā)揮又受細胞基因組的調(diào)節(jié)和控制，涉及到RNA和蛋白質(zhì)合成。
人干擾素有α干擾素（白細胞干擾素），β干擾素（成纖維細胞干擾素），γ干擾素（免疫干擾素）。
干擾素誘生劑：P331
天然干擾素是分子量為2萬的糖蛋白，其作用無特異性，但產(chǎn)生干擾素的動物和被保護的動物之間卻有種屬特異性。不過也有交叉保護作用。干擾素作用時間短，僅幾天。
作用機制：P331,圖10-3
主要抑制病毒的復(fù)制，其可激活宿主DNA,產(chǎn)生抗病毒蛋白（AVP)，與核糖體作用，使其只能合成宿主蛋白，而不能合成病毒蛋白。
3節(jié)：特異性免疫
一、參與特異性免疫的組織器官
胸腺、腔上囊、骨髓、淋巴結(jié)、脾臟。前三者稱中央淋巴組織，后二者稱外周淋巴組織。
二、參與特異性免疫的細胞
免疫活性細胞是指在免疫過程中受抗原刺激后能進行分化、增殖并發(fā)生特異性免疫應(yīng)答的T、B細胞。
免疫細胞主要是各類淋巴細胞、巨噬細胞等
免疫細胞均來源于骨髓干細胞。
1、干細胞：分化圖 P336，圖10-5
2、T淋巴細胞（胸腺依賴淋巴細胞）
T細胞發(fā)育過程（細胞免疫）
T細胞表面標(biāo)志：綿羊紅細胞（sRBC)受體、有絲分裂原受體等。
T細胞分類：
T調(diào)節(jié)細胞 輔助性T細胞(TH)
(TR) 抑制性T細胞（TS)
T效應(yīng)細胞 遲發(fā)型超敏T細胞(TD)
(TE) 細胞毒T細胞(TC)
2、B淋巴細胞（骨髓依賴淋巴細胞）
發(fā)育過程:體液免疫
標(biāo)志：膜表面免疫球蛋白SmIg。
還有一些淋巴細胞，如K細胞、NK細胞等。
3、巨噬細胞
在特異性免疫中，淋巴細胞不易直接接觸抗原，須經(jīng)巨噬細胞吞噬消化，將抗原信息傳遞給淋巴細胞。此外，巨噬細胞還能釋放白細胞介素-1，參與免疫。
三、特異性體液免疫
由抗體介導(dǎo)的免疫
1、中和外毒素
2、調(diào)理作用
3、凝集作用
4、阻止病原菌對粘膜的吸附
四、特異性細胞免疫
致敏T淋巴細胞介導(dǎo)的
1、 TD細胞的作用：釋放淋巴因子，其作用于免疫活性細胞而產(chǎn)生免疫效應(yīng)。
主要的淋巴因子：表10-8
淋巴因子作用無特異性，但其釋放需特異性抗原刺激。
2、 TC 細胞作用：能特異性地識別靶細胞表面抗原，與其結(jié)合，使其溶解。
非特異性免疫與特異性免疫關(guān)系
免疫應(yīng)答（immune
response）：從一個抗原刺激開始，機體內(nèi)抗原特異性淋巴細胞識別抗原（感應(yīng)）后，發(fā)生活化、增殖和分化，表現(xiàn)出一定的體液免疫和細胞免疫的效應(yīng)的過程。
分三階段，兩種類型。
4節(jié)：抗原與抗體Antigen and Antibody
一、抗原
（一）定義：一類能刺激機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞，并能與這些產(chǎn)物在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)，具有一定的化學(xué)結(jié)構(gòu)、物理及生物學(xué)特性，并具有免疫原性（抗原性）和反應(yīng)原性。
免疫原性：刺激機體產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細胞的免疫應(yīng)答能力。
反應(yīng)原性：能和特異性抗體或致敏淋巴細胞結(jié)合，發(fā)生特異性反應(yīng)的能力。
（二）種類
1、完全抗原：具有抗原性和反應(yīng)原性
2、半抗原：只有反應(yīng)原性，沒有抗原性。
（三）性質(zhì)
（免疫原性的物質(zhì)基礎(chǔ)）
1、異物性
1）異種間物質(zhì)
2）同種異體間物質(zhì)：ABO血型，移植排斥。
3）自體隔絕成分
4）自體組織蛋白變性，成為自身抗原。
2、一定的物化特性
1）大分子物質(zhì)
2）一定的結(jié)構(gòu)
3）特異性：由分子表面上的特定化學(xué)基團--抗原決定基所決定的。半抗原實際上就是抗原決定基。任何抗原都可看成是一個載體與半抗原的復(fù)合物。
（四）微生物抗原結(jié)構(gòu)
鞭毛抗原（H抗原）
菌體抗原（O抗原）
表面抗原：如莢膜抗原
外毒素和類毒素
二、抗體
（一）定義：由抗原刺激機體的B細胞，由B細胞轉(zhuǎn)化成漿細胞所產(chǎn)生的具有特異性的免疫球蛋白。Immunoglobulin Ig
抗體在體外可與相應(yīng)抗原作用產(chǎn)生可見反應(yīng)--血清學(xué)反應(yīng)；在體內(nèi)可起抗傳染作用。
（二）種類
IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.
（三）結(jié)構(gòu)
5種Ig結(jié)構(gòu)基本上相似。
單體由4條多肽鏈組成，兩條長鏈稱重鏈（H鏈），兩條短鏈稱輕鏈（L鏈），呈Y字形，鏈間由二硫鍵相連。
P344，圖10-11
不變區(qū)（C區(qū)）與可變區(qū)（V區(qū)），樞紐區(qū)，抗原結(jié)合在V區(qū)。
木瓜蛋白酶水解IgG，可得3個片段，2個相同片段稱Fab（抗原結(jié)合片段），1個片段稱Fc（可結(jié)晶片段）。
因此1個Y字抗體有2個抗原結(jié)合點，是兩價抗體。
胃蛋白酶、巰基試劑水解產(chǎn)物
五類抗體性質(zhì)及特性（補充講義）
（四）抗體形成一般規(guī)律
1、初次反應(yīng)與再次反應(yīng)：圖10-17
2、回憶反應(yīng)
3、幾類抗體出現(xiàn)順序
（五）抗體形成機理
P350 表解
1、誘導(dǎo)學(xué)說（模板學(xué)說）
2、無性繁殖系選擇學(xué)說 P352，圖10-18
3、抗體多樣性分子生物學(xué)機制
（六）淋巴細胞雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體
1、多克隆抗體及缺點
2、淋巴細胞雜交瘤技術(shù)建立 圖 10-20
3、單克隆抗體應(yīng)用
三、抗原抗體反應(yīng)
（血清學(xué)反應(yīng)）
(一）抗原抗體結(jié)合的一般特點
1、高度特異性
2、是分子表面結(jié)合
3、需要合適的比例（區(qū)域現(xiàn)象）
4、反應(yīng)分兩個階段
1）特異結(jié)合階段
2）可見反應(yīng)階段
（二）反應(yīng)組成成分
1、抗原
2、特異抗體
3、環(huán)境因素
基本因素：需電解質(zhì)、溫度、pH等。
特殊因素：有的需補體、白細胞。
（三）反應(yīng)類別
1、沉淀反應(yīng)
抗原、抗體都處于溶解狀態(tài)，按適當(dāng)比例混合后，在電解質(zhì)、溫度適合的條件下，產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象。
抗原稱沉淀原，抗體稱沉淀素。
實驗方法有玻片法、試管法、環(huán)狀試驗、瓊脂擴散法、免疫電泳
2、凝集反應(yīng)：
顆粒性抗原與其特異性抗體在有電解質(zhì)情況下，結(jié)合成可見凝集塊。
抗原稱凝集原，抗體稱凝集素。
與沉淀反應(yīng)區(qū)別
實驗方法有直接凝集實驗、間接凝集實驗、間接凝集抑制實驗（免疫妊娠試驗）、交叉凝集與凝集素吸收實驗（圖10-10）。
3、補體結(jié)合反應(yīng)
補體作用沒有特異性，可與任何抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，但不能單獨與抗原或抗體結(jié)合。
如結(jié)合的抗原是紅細胞，則出現(xiàn)溶血現(xiàn)象；如抗原是細菌，則溶菌；如抗原是自身成分，則發(fā)生免疫損傷。
（1）結(jié)合系統(tǒng)：主要是抗原（可溶性）、抗體及補體，都是液體，無可見反應(yīng)，要有：
（2）指示系統(tǒng)（溶血系統(tǒng)）：羊紅細胞與羊紅細胞抗體（溶血素），若補體被結(jié)合，不溶血，反應(yīng)陽性，說明抗原、抗體是對應(yīng)的；若補體不結(jié)合，則與溶血系統(tǒng)結(jié)合，出現(xiàn)溶血，反應(yīng)陰性，說明抗原、抗體不對應(yīng)。
示意圖：圖10-23
血清學(xué)反應(yīng)總結(jié)（補充講義）
抗原抗體反應(yīng)應(yīng)用（現(xiàn)代免疫標(biāo)記技術(shù)）
1、免疫熒光方法（熒光抗體法）：熒光標(biāo)記抗體，熒光標(biāo)記抗抗體。
2、酶免疫測定：酶標(biāo)記抗體或抗抗體進行抗原抗體反應(yīng)。示意圖：圖10-24
常用酶是辣根過氧化物酶HRP，以二氨基聯(lián)苯胺DRP為底物，產(chǎn)生棕褐色。
雙抗體夾心法和間接免疫吸附法（酶聯(lián)免疫吸附試驗法ELISA、酶標(biāo)法）
3、放射免疫測定法RIA
4、免疫電鏡技術(shù)IEM
5、發(fā)光免疫測定法LIA
各種免疫反應(yīng)的敏感性比較：表10-10
5節(jié)：免疫病理
（變態(tài)反應(yīng)、過敏反應(yīng)）
一、概念
機體再次接受抗原或半抗原刺激后，產(chǎn)生的體液性或細胞性的異常免疫反應(yīng)，從而引起組織損傷或生理機能障礙。
根據(jù)出現(xiàn)癥狀快慢分為速發(fā)性（與抗體有關(guān)）、遲發(fā)性（與致敏T淋巴細胞有關(guān)）變態(tài)反應(yīng)。
二、各型變態(tài)反應(yīng)（補充講義）
6節(jié)：生物制品（自學(xué)）
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