蛋白質(zhì)經(jīng)水解或酶解可由大分子變成小的pro成分，如水解后的產(chǎn)物經(jīng)胨，肽等最后成為氨基酸，氨基酸是構(gòu)成pro最基本的物質(zhì)。

水解后的pro和水解前的pro在物理特性，化學(xué)結(jié)構(gòu)以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差別與水解的程度有密切關(guān)系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也就可以評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

氨基酸不是單純的一種物質(zhì)，用氨基酸分析儀可直接測(cè)定出17種氨基酸（儀器價(jià)格昂貴，不能普遍使用），對(duì)于食品來(lái)說(shuō)有時(shí)有很多種氨基酸可以同時(shí)存在于一種食品中，所以需要測(cè)定總的氨基酸量，它們不能以氨基酸百分率來(lái)表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基酸態(tài)氮）的百分率表示，當(dāng)然，如果食品中只含有一種氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以從含氮量計(jì)算出氨基酸的含量。

食品在評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值時(shí)，除了測(cè)定pro的含量，氨基酸氮含量，還需要對(duì)各種氨基酸進(jìn)行分離，鑒定，尤其對(duì)8種人體必需氨基酸進(jìn)行定量定性分析。

一．單指示劑甲醛滴定法：

1原理：氨基酸具有酸，堿兩重性質(zhì)，因?yàn)榘被�酸含�?/SPAN>-COOH基，而-COOH基顯示酸性，又含有-NH₂，-NH₂則顯示堿性，由于-COOH基和-NH2的相互作用，使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽，當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，-NH2與甲醛結(jié)合，其堿性消失，破壞內(nèi)鹽的存在，就可用堿來(lái)滴定-COOH基，以間接方法測(cè)定氨基酸的量，反應(yīng)式以三種形式存在。

用堿完全中和-COOH基時(shí)的PH值為8.4~9.2。

2試劑：

（1）40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，將甲醛用1N NaOH溶液中和（淡蘭色）。（2）0.1%百里酚酞乙醇溶液。

（3）0.100N  NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3操作步驟：

稱約含20mg左右的氨基酸→于燒杯中（如為固體樣加水50ml）→加兩滴指示劑→用0.1N NaOH溶液滴定到淡蘭色→加中性甲醛20ml→搖勻→靜置1分鐘→此時(shí)蘭色應(yīng)消失→再用0.1N NaOH溶液滴定淡蘭色，記錄兩次滴定所消耗的堿液毫升數(shù)。

計(jì)算：氨基酸態(tài)氮=（N×V×0.014×100）/W×100

二．雙指示劑甲醛滴定法

1原理：

與單色法相同，只是在此法中使用了兩種指示劑，從分析結(jié)果看，雙指示劑甲醛滴定法與

亞硝酸氮?dú)馊萘糠ǎù朔ú僮鲝?fù)雜，但準(zhǔn)確，不作介紹）相近，單色滴定法稍偏低，主要

因?yàn)閱沃甘緞┘兹┑味ǚㄊ且园被�酸溶液�?/SPAN>PH值作為中性紅的終點(diǎn)，PH值為7.0，從理論計(jì)

算看，雙色滴定法比單色滴定法準(zhǔn)確。

2試劑：同單指示劑一樣，多一個(gè)0.1%中性紅（50%乙醇溶液）

3操作步驟：

取相同兩份樣品→分別于100ml三角瓶→一份加中性紅2滴→用0.1N  NaOH滴定終點(diǎn)（由紅

變琥珀色），記錄用量，另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml→搖勻→用0.1N 

NaOH 滴至淡蘭色。

計(jì)算：

氨基酸態(tài)氮=（N×（V2-V1）×0.014×100）/W×100

V1——用中性紅為指示劑時(shí)，堿液所消耗的體積

V2——用百里酚酞乙醇液為指示劑時(shí)標(biāo)液消耗量

0.014——氮的毫克當(dāng)量濃度

注意事項(xiàng)：

（1）單色指示劑甲醛滴定法，用堿完全中和—COOH基時(shí)的pH為8.5—9.5

（2）測(cè)定樣品的顏色較深，應(yīng)加活性炭脫色之后再滴定

三．茚三酮比色法：

1原理：氨基酸在一定pH范圍內(nèi)，能與茚三酮生成蘭紫色化合物�？梢杂帽壬�法定量測(cè)定。

2試劑：

（1）磷酸緩沖液（pH.8.04）制備方法如下：

稱磷酸二氫鉀4.5350g。定容500ml

稱NAH₂PO₄·12H₂O   11.9380g分別溶解定容500ml

取磷酸二氫鉀10ml與磷酸氫二鈉190ml混合即為pH8.04的緩沖液

（2）2%茚三酮溶液：

稱茚三酮1g→溶于35ml熱水→加入40mg氯化亞錫（SnCl₂·H₂O）攪拌過濾（作防腐劑）→

于冷暗處過夜→定容50ml

①  氨基酸標(biāo)液

稱干燥氨基酸（如異亮氨酸）0.2000g→溶解定容100ml→搖勻→吸10ml于另外100ml容量瓶

定容100ml，即得200Ug/ml標(biāo)液

3操作方法：

（1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：

取7個(gè)25ml容量瓶，吸取標(biāo)液 0   0.5   1.0   1.5   2.0   2.5   3.0ml于7個(gè)25ml容量瓶，加水補(bǔ)充

至容積為4ml，然后加茚三酮和緩沖液各1ml，于水浴加熱15分鐘，冷卻后定容25ml，靜置

15分鐘，在570nm下測(cè)消光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品測(cè)定：

取樣品5.00~10.0g（液體樣5-10ml）→于燒杯中→加50ml水和活性碳約5g→加熱過濾→用

30—40ml熱水洗滌活性炭→吸澄清樣液1~4ml→加茚三酮和緩沖液各1ml水浴加熱15分鐘，

冷卻定容，靜置15分鐘于570nm下測(cè)定消光值，按下式計(jì)算氨基酸含量。

氨基酸含量（毫克/100克）=C/（W×1000）×100

C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得得氨基酸的量（Ug）

W——測(cè)定得樣品溶液相當(dāng)于樣品的量（g）

注意事項(xiàng)：

茚三酮受陽(yáng)光、溫度、濕度、空氣等影響易被氧化呈淡紅或深紅色，使用前要進(jìn)行純

化，方法如下：、

取10g茚三酮容于40ml熱水中，加一克活性炭，搖勻靜置30分鐘，過濾，將濾液放入冰箱中

過濾，即出現(xiàn)蘭色結(jié)晶，過濾，用2ml冷水洗滌結(jié)晶，置干燥皿中干燥，裝瓶備用。

思考題：

1 試述蛋白質(zhì)測(cè)定中，樣品消化過程所必須注意的事項(xiàng)，消化過程中內(nèi)容物顏色發(fā)生什么變化？為什么？

2 樣品經(jīng)消化進(jìn)行蒸餾前，為什么要加入氫氧化鈉？這時(shí)溶液發(fā)生什么變化？為什么？如果沒有變化，說(shuō)明什么問題？須采用什么措施？

3 硫酸銅及硫酸鉀在測(cè)定中起了什么作用？
4 試述氨基酸態(tài)氮的測(cè)定原理�！�

5 結(jié)果計(jì)算中為什么要乘上蛋白質(zhì)系數(shù)？

實(shí)驗(yàn)：①水果中酸度的測(cè)定。

            ②糕點(diǎn)中和脂肪的測(cè)定。