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生產(chǎn)環(huán)境和產(chǎn)品接觸面的采樣及檢驗(yàn)方法！
目的
檢測生產(chǎn)車間操作人員手部、與食品有直接接觸面的機(jī)械設(shè)備的微生物指標(biāo)，生產(chǎn)區(qū)域環(huán)境當(dāng)中病原微生物的監(jiān)控，達(dá)到規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，以控制食品成品的質(zhì)量。 參照標(biāo)準(zhǔn)
中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB 15979－2002、《HACCP原理與實(shí)施》、出入境檢驗(yàn)檢疫局二000四年《出入食品微生物檢驗(yàn)培訓(xùn)教材》中《出入食品生產(chǎn)廠衛(wèi)生細(xì)菌檢驗(yàn)方法》、日本東京冷凍食品檢驗(yàn)方法。 采樣與檢測方法
3.1 工作臺（機(jī)械器具）表面與工人手表面采樣與測試方法： 3.1.1 樣品采集： (1)取樣頻率： ①車間轉(zhuǎn)換不同衛(wèi)生要求的產(chǎn)品時，在加工前進(jìn)行擦拭檢驗(yàn)，以便了解車間衛(wèi)生清掃消毒情況。 ②全廠統(tǒng)一放長假后，車間生產(chǎn)前，進(jìn)行全面擦拭檢驗(yàn)。 ③產(chǎn)品檢驗(yàn)結(jié)果超內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)及時對車間可疑處進(jìn)行擦拭，如有檢驗(yàn)不合格點(diǎn)，整改后再進(jìn)行擦拭檢驗(yàn)。 ④實(shí)驗(yàn)新產(chǎn)品，按客戶規(guī)定擦拭頻率擦拭檢驗(yàn)。 ⑤對工作表面消毒產(chǎn)生懷疑時，進(jìn)行擦拭檢驗(yàn)。 ⑥正常生產(chǎn)狀態(tài)的擦拭，每周一次。 （2）采樣方法： ①工作臺（機(jī)械器具）：用浸有滅菌生理鹽水的棉簽在被檢物體表面（取與食品直接接觸或有一定影響的表面）取25c㎡的面積，在其內(nèi)涂抹10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)送檢。 ②工人手：被檢人五指并攏，用浸濕生理鹽水的棉簽在右手指曲面，從指尖到指端來回涂擦10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)送檢。
（3）采樣注意事項(xiàng)： 擦拭時棉簽要隨時轉(zhuǎn)動，保證擦拭的準(zhǔn)確性。對每個擦拭點(diǎn)應(yīng)詳細(xì)記錄所在分場的具體位置、擦拭時間及所擦拭環(huán)節(jié)的消毒時間。
3.1.2 菌落總數(shù)·大腸菌群的檢測培養(yǎng): 樣液稀釋：將放有棉棒的試管充分振搖。此液為1：10稀釋液。如污染嚴(yán)重，可十倍遞增稀釋，吸取1mL 1：10樣液加9mL無菌生理鹽水中，混勻，此液為1：100稀釋液。 3.1.2.1 菌落總數(shù)：（按GB 4789.2的規(guī)定進(jìn)行） （1）以無菌操作，選擇1～2個稀釋度各取1ml樣液分別注入到無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿（平行樣），將已融化冷至45℃左右的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾入平皿，每皿約15~20mL，充分混合。 （2）待瓊脂凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，置36℃±1℃ 培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。 （3）結(jié)果報告：報告每25c㎡食品接觸面中或每只手的菌落數(shù)。 3.1.2.2 大腸菌群：（按GB 4789.3的規(guī)定進(jìn)行） （1）平板法： a)以無菌操作，選擇1～2個稀釋度各取1mL樣液分別注入到無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿（平行樣），將VRBA培養(yǎng)基傾入平皿，每皿約15~20mL，充分混合。待瓊脂凝固后,再覆蓋一層培養(yǎng)基，約3-5 mL。 b)待瓊脂凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，置36℃±1℃培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)。 c)證實(shí)實(shí)驗(yàn)：從VRBA平板上挑取典型和可疑菌落接種BGLB進(jìn)行證實(shí)實(shí)驗(yàn)。 d)結(jié)果計(jì)算：經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以平板上出現(xiàn)的典型和可疑菌落個數(shù)乘以稀釋倍數(shù)得出。 e）結(jié)果報告：報告每25c㎡食品接觸面中或每只手的菌落數(shù)。 （2）MPN法： a)以無菌操作，選擇3個稀釋度各取1mL樣液分別接種到LST肉湯培養(yǎng)基中，每個稀釋度接種三管。 b)置LST肉湯管于36℃±1℃培養(yǎng)48±2h。記錄所有LST肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù)。 c)選擇產(chǎn)氣渾濁的發(fā)酵管接種BGLB進(jìn)行復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。 d）結(jié)果報告：按BGLB肉湯管產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表報告每25c㎡食品接觸面中或每只手的大腸菌群值。 3.1.2.3 金黃色葡萄球菌檢測（按GB4789.10的規(guī)定進(jìn)行） （1）定性檢測 a)取1mL稀釋液注入滅菌的平皿內(nèi)，傾注15-20mL的B-P培養(yǎng)基，（或是吸取0.1稀釋液，用L棒涂布于表面干燥的B-P瓊脂平板），放進(jìn)36±1℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2小時。 b)從每個平板上至少挑取1個可疑金黃色葡萄球菌的菌落作血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)。 c)結(jié)果報告：B-P瓊脂平板的可疑菌落作血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)為陽性，即報告手（工器具）上有金黃色葡萄球菌存在。 （2）定量檢測 a)以無菌操作，選擇3個稀釋度各取1mL樣液分別接種到含10﹪氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，每個稀釋度接種三管。 b)置肉湯管于36±1℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48小時。劃線接種于表面干燥的B-P瓊脂平板，置36℃±1℃ 培養(yǎng)45～48小時。 c)從B-P瓊脂平板上，挑取典型或可疑金黃色葡萄球菌菌落接種肉湯培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)20～24小時。 d)取肉湯培養(yǎng)物做血漿凝固酶試驗(yàn)，記錄試驗(yàn)結(jié)果。 e)報告結(jié)果：根據(jù)凝固酶試驗(yàn)結(jié)果，查MPN表報告每25c㎡食品接觸面中或每只手的金黃色葡萄球菌值。
關(guān)于培養(yǎng)基的選擇
一次性衛(wèi)生用品生產(chǎn)企業(yè)使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基檢測涂抹點(diǎn)的菌落總數(shù)，使用乳糖膽鹽培養(yǎng)基檢測采樣點(diǎn)的大腸菌群。針對檢測目的不同食品企業(yè)可以選擇不同的培養(yǎng)基，比如檢測消毒處理后或生產(chǎn)過程中受污染的程度，可以選擇平板計(jì)數(shù)瓊脂檢測菌落總數(shù)；檢測大腸菌群可以選擇乳糖膽鹽培養(yǎng)基。
關(guān)于采樣點(diǎn)的選擇
選擇食品接觸面，食品接觸面是指生產(chǎn)過程中與所生產(chǎn)的食品直接接觸的設(shè)備、工具器具、人、水、空氣、包材等；或直接接觸的門把手、電源開關(guān)等。
3.2 工廠環(huán)境中病原體的檢測計(jì)劃與方法： 檢測計(jì)劃：為了保證食品安全，工廠應(yīng)該對生產(chǎn)環(huán)境中的病原微生物進(jìn)行檢測和評估，檢測項(xiàng)目包括李斯特菌，沙門氏菌等病原體微生物，化驗(yàn)室應(yīng)該按照一定的計(jì)劃對生產(chǎn)場所環(huán)境中的病原體進(jìn)行檢測，其中包括地面、下水道、排水溝、墻壁、天花板、設(shè)備框架、運(yùn)輸?shù)闹Ъ�，冷藏裝置、速凍機(jī)、傳送帶、設(shè)備的螺絲、維修工具等部位。當(dāng)某個點(diǎn)檢測到病員微生物時，應(yīng)該對環(huán)境中的相似點(diǎn)加大檢測頻率；在把所有的預(yù)定點(diǎn)檢測完后，應(yīng)該對環(huán)境中的病原微生物的存在狀況進(jìn)行全面評估，在下一次環(huán)境檢測循環(huán)過程中加強(qiáng)檢測容易出現(xiàn)病原體的環(huán)境點(diǎn)，達(dá)到持續(xù)改進(jìn)的目的。 檢測頻率: 每月兩次,每次每個區(qū)域至少選取5個檢測點(diǎn),分別進(jìn)行檢測。 3.2.1 環(huán)境李斯特菌的檢測方法（3MTM PetrifilmTM 環(huán)境李斯特菌的測試片） 3.2.1.1 用涂抹棒，海綿或者其他采樣設(shè)備收集環(huán)境樣本。 3.2.1.2 將收集的樣本添加10毫升滅菌的緩沖蛋白胨水，將樣本與緩沖蛋白胨混合1分鐘，將樣品置于室溫（20-30℃）1小時，最久不超過1.5小時，以修復(fù)損傷的李斯特菌。 3.2.1.3 將測試片放在平坦處，掀起上層膜。 3.2.1.4 用移液器垂直滴加3毫升樣品到下層膜中央，將上層膜緩慢蓋下，以免產(chǎn)生氣泡。 3.2.1.5 輕輕將塑料壓板放在位于接種區(qū)上層膜上，不要壓，扭轉(zhuǎn)或者滑動壓板。提起壓板等至少十分鐘，以使膠體凝固。 3.2.1.6 將測試片透明面朝上，可疊放至十片，在37℃±1℃培養(yǎng)26-30小時，可以用標(biāo)準(zhǔn)菌落記數(shù)器或者其他光學(xué)放大器判讀，不要記數(shù)圓形輪廓上的菌落，因?yàn)樗麄儾皇苓x擇性培養(yǎng)基的影響。 3.2.1.7 對于定性檢測，根據(jù)紫紅色菌落是否存在，結(jié)果記為檢出或者未檢出。 3.2.2 環(huán)境中沙門氏菌的檢測方法 3.2.2.1 采樣地點(diǎn): 選取采樣點(diǎn)時因盡量選取微生物容易滋生的地方。
3.2.2.2 操作步驟 3.2.2.2.1 采樣應(yīng)在生產(chǎn)開始后進(jìn)行，用已浸潤過的棉拭在選定的被測表面旋轉(zhuǎn)涂抹約100c㎡的面積，然后將棉拭放回涂抹試管并蓋緊。
a.手內(nèi)側(cè)涂抹
b.手外側(cè)涂抹
c.手指間涂抹
d.將棉簽浸入裝有無菌水的試管中
（涂抹前準(zhǔn)備好培養(yǎng)基）
3.3.2.2.2 將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，每5個點(diǎn)混合成一個樣品,登記編號,按照GB 4789.4-2016標(biāo)準(zhǔn)及時檢測，若有陽性結(jié)果出現(xiàn)，應(yīng)逐步對所混合的每個點(diǎn)分別檢測。
