Sean M. McCarthy, Andrew J. Aubin, 和 Michael D. Jones

沃特世公司(美國馬薩諸塞州米爾福德)

■ 快速分離短桿菌肽

■ 載量線性響應

■ 準確、高精度分析短桿菌肽的方法

■ 有可能用于其它疏水性肽和蛋白質(zhì)
 

ACQUITY UPC2系統(tǒng)
ACQUITY® SQD
ACQUITY UPC2 CSH氟苯基色譜柱

Empower™ 3軟件
 

超高效合相色譜、UPC2、疏水性肽、短桿菌肽

用反相液相色譜(RPLC)分析疏水性肽和蛋白質(zhì)難度很大，因為溶液中經(jīng)常需要使用洗滌劑保持疏水性物質(zhì)的穩(wěn)定性，而這些洗滌劑容易發(fā)生聚集和/或沉淀，嚴重影響它們的回收，這些因素以及其它原因使得難以用RPLC分離疏水性肽和蛋白質(zhì)。
 

在本應用紀要中，我們?yōu)槟�介紹一種在ACQUITY UPC2TM系統(tǒng)上使用沃特世(Waters®)超高效合相色譜技術分離典型跨膜肽-短桿菌肽的方法。
 

短桿菌肽是由芽孢桿菌產(chǎn)生的一種常見和已被良好表征的跨膜肽物質(zhì)，它被用作對抗革蘭氏陽性和某些革蘭氏陰性細菌的局部用抗生素，短桿菌肽包括通用組成為甲酰-L-纈氨酸-甘氨酸-L-丙氨酸-D-亮氨酸-L-丙氨酸-D-纈氨酸-L-纈氨酸-D-纈氨酸-L-色氨酸-D-亮氨酸-L-X-D-亮氨酸-L-色氨酸-D-亮氨酸-L-色氨酸-氨基乙醇的一族化合物，其中X取決于短桿菌肽分子，即分別占總短桿菌肽量約87.5%、7.1%和5.1%的革蘭氏A(X=色氨酸)、革蘭氏B(X=苯丙氨酸)和革蘭氏C(X=酪氨酸)，1需要交替的D和L氨基酸單元構(gòu)成_-螺旋狀。
 

我們研究了色譜柱化學品、流動相改性劑和梯度斜率對分離短桿菌肽的影響。采用優(yōu)化方法分離市場上銷售的非處方藥物(OTC)，將測定的短桿菌肽濃度與標示量進行對比。采用質(zhì)譜儀測定短桿菌肽的濃度，采用選擇離子譜表征每種物質(zhì)。在ACQUITY  UPC2系統(tǒng)上使用我們的方法，可得到線性和可重復的結(jié)果——測定的OTC制劑濃度為標示量的98.4%。

測試條件
 

除非另有說明，以下是用于所有色譜最終方法的最佳條件。

UPC2測試條件

UPC2系統(tǒng): ACQUITY UPC2

檢測器： PDA、ACQUITY SQD PDA @ 280nm,分辨率為6 nm(補償400至500 nm)

色譜柱： ACQUITY UPC2CSH 氟苯基,3.0 x 100 mm, 1.7 μm

柱溫： 50 °C

樣品溫度： 15 °C

UPC2 ABPR: 1885 psi

進樣量： 1 μL

流速： 2.0 mL/min

流動相A： CO2

流動相B： 含0.1%TFA的甲醇(除非另有標示)

梯度： 20%至30% B，1.5min
 

離子源： ES+

錐孔電壓： 20 V

毛細管電壓： 3.7kV

源溫度： 150 °C

脫溶劑氣溫度： 500 °C

脫溶劑氣體流速： 400 L/hr

錐孔氣體流速： 25 L/hr

SIR: 922.6,930.3,941.9
 

用解硫胺素芽孢桿菌(短芽孢桿菌)制備的短桿菌肽從Sigma Aldrich公司購買，將樣品溶解在甲醇中制成0.5mg/mL濃度的溶液，如需要，可用甲醇稀釋。含有短桿菌肽的非處方軟膏是從當?shù)厮幍曩徺I的。將0.2g軟膏溶解在10mL正己烷中，然后用5mL甲醇萃取短桿菌肽，去除甲醇層，用0.2-μm的燒結(jié)玻璃盤過濾，然后直接進樣ACQUITY UPC2。
 

我們系統(tǒng)性地篩選了四種色譜柱，測定哪種分離效果最佳，結(jié)果如圖1所示，色譜柱篩選過程可在1小時內(nèi)非常快速地完成。在我們設定的篩選條件下，BEH 2-EP和BEH色譜柱未檢測到譜峰，由于其它色譜柱表現(xiàn)出合適的色譜性能，因而未對這兩者的非洗脫原因深入研究，其中ACQUITY UPC2CSH氟苯基色譜柱檢測的色譜峰形最佳，因此采用該色譜柱繼續(xù)研究。

圖1.通過短桿菌肽標準物的色譜峰形和保留時間篩選各種化學特性色譜柱。所有色譜柱規(guī)格為3.0x100mm，填裝亞-2-微米填料；所有分離條件都采用流動相 A：CO2 、流動相 B、含0.1% FA的MeOH、2 mL/min, 3%B至25% B，5min。
 

為了分離短桿菌肽物質(zhì)，對酸性改性劑的影響進行了研究，結(jié)果表明：使用三氟乙酸(TFA)可得到稍好的峰形，提高了短桿菌肽A和短桿菌肽C之間的分離度，結(jié)果如圖2所示。已知TFA會抑制質(zhì)譜電離，但每種物質(zhì)的信號都足以定量檢測治療制劑，后續(xù)將對此進行討論。對于要求更高靈敏度的應用，可能需要降低TFA濃度或使用甲酸，以達到希望的檢測限值。

圖2.酸性改性劑對分離短桿菌肽的影響。
 

當設置好合適色譜條件后，通過減少梯度時間優(yōu)化分離過程，結(jié)果如圖3所示，我們能夠在1.5分鐘時間內(nèi)使每種短桿菌肽組分的分離度達到1.4或更高，在相同流速下通過減少運行時間增加梯度斜率，不但實現(xiàn)有效分離，同時還將短桿菌肽A的信噪比從336提高至605。

我們測試了最佳分離條件，能夠使用單四極桿質(zhì)譜(SQD)檢測每種物質(zhì)，圖4顯示：每種物質(zhì)都被質(zhì)譜良好分離和檢測到，另外每種短桿菌肽物質(zhì)都顯示含有絕大多數(shù)的M+2H離子，后續(xù)的研究將使用這些參數(shù)進行選擇離子監(jiān)測。

為了評估我們的方法是否適用于定量分析市場上銷售的非處方藥中的短桿菌肽，我們在ACQUITY SQD上使用選擇離子監(jiān)測，結(jié)果如圖5A所示。我們繪制濃度-峰面積曲線，得到每種物質(zhì)的校正曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：如圖5B-D所示，每種成分在測試范圍內(nèi)都呈線性響應。另外還使用校正曲線測定了非處方藥物中的每種短桿菌肽物質(zhì)濃度。

使用開發(fā)的方法評估非處方藥物中的短桿菌肽物質(zhì)的濃度和相對豐度。如圖6所示，重復分析結(jié)果表明：每種短桿菌肽%RSD值小，計算濃度與標簽上的標稱值相吻合；我們還發(fā)現(xiàn)短桿菌肽物質(zhì)的相對豐度與文獻報道的豐度非常吻合1。

正如本應用紀要所展示的，ACQUITYUPC2系統(tǒng)與ACQUITYUPC2色譜柱化學結(jié)合使用，可為短桿菌肽提供簡單、準確和可重現(xiàn)的分析方法。該工作表明ACQUITY UPC2系統(tǒng)可用于分析疏水性肽，還可能用于分析疏水性蛋白質(zhì)，例如膜蛋白。
 

The Merck Index and Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals.13th ed. Whitehouse Station, NJ : Merck Research Laboratories; 2001.