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從1996年轉(zhuǎn)基因作物開(kāi)始進(jìn)行大規(guī)模商業(yè)化以來(lái)，它在全球的種植面積迅速擴(kuò)大，目前全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達(dá)25億公頃，同時(shí)轉(zhuǎn)基因作物的種類和轉(zhuǎn)基因性狀也在不斷豐富。但是轉(zhuǎn)基因作物作為一種新物種，其對(duì)人體健康、生態(tài)平衡是否具有危害還未確定。許多國(guó)家以立法或其他形式要求對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)記。我國(guó)于2017年頒布《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》，對(duì)轉(zhuǎn)基因生物安全有了更新的要求。因此轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)就顯得尤為重要。
轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)主要從兩個(gè)方面入手，一是核酸水平，即檢測(cè)遺傳物質(zhì)中是否含有插入的外源基因；二是蛋白質(zhì)水平，即通過(guò)插入外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物或其功能進(jìn)行檢測(cè)，或者是檢測(cè)插入外源基因?qū)d體基因表達(dá)的影響，主要檢測(cè)外源基因?qū)Σ迦胛稽c(diǎn)附近基因影響及對(duì)其代謝產(chǎn)物的影響。
核酸水平的檢測(cè)
主要檢測(cè)報(bào)告基因、啟動(dòng)子和終止子，是當(dāng)前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)的重要手段。最常見(jiàn)的是對(duì)camv35s啟動(dòng)子或nos終止子的檢測(cè)，但是僅僅鑒定篩選基因，已經(jīng)不能滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)的要求。這是因?yàn)?5s啟動(dòng)子存在于椰菜花葉病毒，nos終止子存在于植物病毒ti質(zhì)粒中，抗生素類的報(bào)告基因自然界中也普遍存在，因而僅是檢測(cè)篩選基因，極易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)也達(dá)不到鑒定轉(zhuǎn)基因植物的目的。核酸水平的檢測(cè)可以分為定性和定量?jī)煞N。
1、
定性檢測(cè)
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
1996年德國(guó)伯恩斯坦大學(xué)的Meyer Rolf等論證了PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品的可能性。利用該方法在鑒定轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆RoundUp ReadyTM Soybean(RRS)和轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米系列標(biāo)準(zhǔn)品Btl76 Maxi maizer的實(shí)驗(yàn)中，可以檢測(cè)到僅為0．5％轉(zhuǎn)基因成分。Matsuoka等通過(guò)對(duì)7種轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)入的外源基因的序列分析，設(shè)計(jì)了14對(duì)檢測(cè)該7種轉(zhuǎn)基因玉米啟動(dòng)子、終止子和結(jié)構(gòu)基因的引物，分別對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米、非轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆、非轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行了PCR擴(kuò)增檢測(cè)，同時(shí)為檢測(cè)所設(shè)計(jì)引物的特異性，還對(duì)其他作物如水稻、大麥、小麥等進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，檢驗(yàn)結(jié)果表明該方法能夠快速有效地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米品種。每一次實(shí)驗(yàn)均需要設(shè)有陰性及陽(yáng)性對(duì)照以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性。在樣品采集及處理過(guò)程中也需要注意防止污染。
多重PCR是常規(guī)PCR方法的改進(jìn)，它是在同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因序列。這種方法具有更大的可靠性和適應(yīng)性，并且能降低檢測(cè)成本。多重PCR可以同時(shí)針對(duì)幾個(gè)靶位點(diǎn)進(jìn)行PCR技術(shù)檢測(cè)。V．T．Forte等利用其設(shè)計(jì)的多重PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆和Bt玉米樣品進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)，結(jié)果表明該方法能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)食品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，其檢測(cè)結(jié)果可以精確到2％～0．1％的范圍。Permingeat等僅用兩對(duì)引物就可同時(shí)檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因玉米Btl76、 MON810、Btll和T25的CrylA(b)和pat基因。多重 PCR也可同時(shí)準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出Roundup Ready大豆的 NOS和epsps序列片段。
巢式PCR(nested PCR)是在普通PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種PCR技術(shù)。其原理是設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，其中一對(duì)引物在另一對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的片段上，通過(guò)二次PCR反應(yīng)對(duì)某個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)。
以放射性或熒光標(biāo)記的外源目的基因的同源序列作為探針與該食品原料農(nóng)產(chǎn)品的總DNA進(jìn)行雜交。首先用限制酶消化受體總DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳按大小分離所得的片斷，隨后使DNA在原位發(fā)生變性，并從凝膠轉(zhuǎn)移至一固相支持體上。DNA轉(zhuǎn)移至固相支持體的過(guò)程中，各個(gè)DNA片斷的相對(duì)位置保持不變，用放射性或熒光標(biāo)記的探針與各個(gè)DNA片斷雜交，經(jīng)放射自顯影確定與探針互補(bǔ)的電泳條帶的位置。核酸印記法技術(shù)用于食品外源基因的檢測(cè)可檢測(cè)出外源基因與內(nèi)源基因有高度同源性的DNA片斷，且準(zhǔn)確可靠，但對(duì)樣品的純度要求較高，費(fèi)用也較高。
通過(guò)比較要擴(kuò)增的樣品中目標(biāo)DNA和在同一體系中進(jìn)行擴(kuò)增的已知量的競(jìng)爭(zhēng)性DNA而得到的，競(jìng)爭(zhēng)性DNA必須與目標(biāo)DNA具有相同的引物和不同的分子量，以便二者既能同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)又能使擴(kuò)增后的兩種產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳區(qū)分開(kāi)來(lái)。Anastasia k等在競(jìng)爭(zhēng)性PCR的基礎(chǔ)上，對(duì)雙競(jìng)爭(zhēng)性定量PCR(Double cmantitative competitive PCR，DCPCR)進(jìn)行了研究，并與實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行了比較，證明競(jìng)爭(zhēng)性PCR具有靈敏度高、探針價(jià)格更低廉的優(yōu)點(diǎn)。
這是在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中非常重要的一種檢測(cè)技術(shù)。在該體系中，除了兩條普通的引物外，還有一條在5’和3’端分別標(biāo)記了報(bào)告熒光染料基團(tuán)(R)、粹滅熒光染料基團(tuán)(Q)，并與PCR產(chǎn)物特異片段結(jié)合的寡核苷酸探針。它通過(guò)分析起始拷貝數(shù)的方式以標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而判定待檢產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因含量。在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中閉管操作，使用熒光染料特異標(biāo)記PCR產(chǎn)物，實(shí)時(shí)顯示PCR產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)積累，且沒(méi)有繁雜的后續(xù)處理過(guò)程，避免了產(chǎn)物的污染，方法快捷、靈敏、有效。
多重?zé)晒釶CR技術(shù)是多重PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)合，該技術(shù)除了應(yīng)用轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)外，還有著廣泛的應(yīng)用前景和領(lǐng)域。多重?zé)晒釶CR可同時(shí)檢測(cè)多種病原細(xì)菌，具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、特異的優(yōu)點(diǎn)。
1、蛋白質(zhì)印跡法
蛋白質(zhì)印跡法將電泳較高的分離能力、抗體的特異性和顯色酶反應(yīng)的靈敏性結(jié)合起來(lái)，是檢測(cè)復(fù)雜混合物中特異蛋白質(zhì)的最有力的工具之一。普遍用于分離、檢測(cè)特異的目的蛋白質(zhì)，靈敏度為1 ng～5 ng。它可確定一個(gè)樣品中是否含有低于或超過(guò)預(yù)定限值水平的目的蛋白質(zhì)，特別用于不可溶蛋白質(zhì)的分析。van Duijn等用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Roundup Ready大豆中的 CP4合成酶，檢測(cè)限在0．5％一1％。驗(yàn)證該方法可對(duì)大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)。
2、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
這種蛋白質(zhì)檢測(cè)方法具有商業(yè)可利用性并具有高度選擇性和靈敏性。免疫測(cè)定的主要缺點(diǎn)之一是復(fù)雜基質(zhì)對(duì)它的準(zhǔn)確性和精確度有干擾，如加工的蔬菜和食品。某些導(dǎo)入蛋白質(zhì)并不是在植物的所有組織中均有表達(dá)，例如在玉米中一些蛋白質(zhì)大部分表達(dá)在葉子中，而不在谷粒中。
其他檢測(cè)方法
隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)研究的深入以及各國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)要求的提高，迫切地需要更準(zhǔn)確、快速、安全、高效且成本低廉的檢測(cè)技術(shù)的問(wèn)世。除了上面介紹的方法外，還有一些其它的檢測(cè)方法。目前，色譜技術(shù)(HPLC)、近紅外波譜技術(shù)(NIR)、毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)、超分支滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(HRCA)以及基于一些成熟技術(shù)建立起來(lái)的試劑盒技術(shù)、試紙條技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品的實(shí)際檢測(cè)中都有所應(yīng)用。
轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)方法多種多樣，各有其優(yōu)缺點(diǎn)。在實(shí)際的檢測(cè)中，并非任何一種檢測(cè)方法對(duì)某種轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)都行之有效。應(yīng)該根據(jù)食品種類和加工類型的不同，以及食品中可能含有的轉(zhuǎn)基因片段的不同，選擇最有效的檢測(cè)方法。同時(shí)，現(xiàn)有的檢測(cè)方法也在不斷的改進(jìn)中，隨著各國(guó)有關(guān)轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)簽法的建立和不斷完善，對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的準(zhǔn)確定量檢測(cè)顯得日趨重要。這就要求，轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)方法向著高質(zhì)量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性、自動(dòng)化和低成本的方向發(fā)展。
